Патогенетические механизмы формирования наружного генитального эндометриоза и его стадий у пациенток репродуктивного возраста 14. 00. 01- акушерство и гинекология

Вид материала

Автореферат

Содержание Биохимические методы исследования Определение NO, NOS в сыворотке крови и перитонеальной жидкости. Генетические исследования Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови Статистическая обработка данных при генетическом исследовании.

Подобный материал:

• Современные методы лечения маточных кровотечений у пациенток репродуктивного возраста., 314kb.
• Клинико-морфологическая характеристика изменений эутопического и эктопического эндометрия, 417.6kb.
• Бесплодие у женщин позднего репродуктивного возраста: принципы диагностики и лечения, 587.77kb.
• Особенности клинического течения и диагностики урогенитальных инфекций, обусловленнных, 284.85kb.
• Механизмы формирования тромбоопасности при эндоскопических вмешательствах на органах, 460.72kb.
• Особенности репродуктивного здоровья девушек-подростков с ожирением различного генеза, 333.79kb.
• Значение аблации эндометрия в терапии гиперпластических процессов эндометрия пациенток, 411.8kb.
• Громова Алина Валерьевна Состояние репродуктивного здоровья девушек-подростков с вирусными, 354.32kb.
• Примерная программа наименование дисциплины «акушерство и гинекология» Рекомендуется, 499.66kb.
• Новые направления организации перинатальной помощи в охране и реализации репродуктивного, 838.72kb.

Биохимические методы исследования Определение содержания факторов роста, молекул межклеточного взаимодействия, гормонов, антиовариальных антител, антител к кардиолипину, опухолевоассоциированного антигена СА-125 в сыворотке крови и перитонеальной жидкости. Вышеперечисленные соединения определяли в сыворотке крови и перитонеальной жидкости с помощью иммуноферментного анализа. Взятие крови производили следующим образом: у пациенток из локтевой вены натощак брали 5,0 мл крови. Кровь центрифугировали в течение 15 минут при 1500 оборотов в минуту. Отбирали сыворотку крови в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и хранили при температуре - 20°С. Перитонеальную жидкость получали из позади-маточного пространства при выполнении лапароскопии. Для ЭФР, СЭФР-А, оФРФ, ФНО-α использовали иммуноферментные наборы (Cytimmune systems, USA). Аналитическая чувствительность методов 8,3 пг/мл, 18,6 пг/мл, 0,48пг/мл и 8,8 пг/мл соответственно. О высокой воспроизводимости методов свидетельствовали следующие коэффициенты вариации: для ЭФР интра- и интер- коэффициенты вариации измеренных уровней составили соответственно – 7,0% и 10,6%, для СЭФР-А вариации внутри серии – 8,9%, между сериями – 11,1%, для оФРФ – 8,2% и 10,1% и для ФНО-α – 7,7% и 6,54% соответственно. Содержание ИФР-1 и ТФР-β определяли иммуноферментными наборами «R&Dsystems», USA. Чувствительность методов – 10,1 пг/мл и 4,8 пг/мл соответственно. Вариации внутри серии – 3,3%, между сериями – 8,6% - для ИФП-1 и для ТФРβ – 8,3% и 10,8% соответственно. Принцип этих методов заключается в ферментативно-усиленном двухстадийном анализе «сэндвичевого» типа. Стандарты, контроли и предварительно разведенные образцы сыворотки и ПЖ инкубировали в лунках планшета, сорбированных антителами к вышеуказанным факторам роста. После инкубации и промывки ячейки инкубируются с другими антителами к факторам роста, меченым соответствующими ферментами. В наборах «Cytimmune systems» используют сорбированные мышиные моноклональные антитела, другие специфические кроличьи античеловеческие поликлональные антитела связываются с конъюгатом стрептавидина и щелочной фосфатазы. Субстратом является НАДФН, который щелочная фосфатаза дефосфорилирует до НАДН, служащего кофактором, активизирующим циклическую реакцию окисления - восстановления, управляемую алкогольдегидрогеназой и диафоразой. В реакции образуется окрашенный продукт красного цвета (формазин), определяемый при 490 нм. Стандартная кривая показывает прямую цитокины, входящие в состав тест-наборов. ММП-9, сVCAM1, sFASL определяли методом иммуноферментного анализа наборами фирмы Bender MedSystems (Austria). Определение антител к кардиолипину (анти-кардиолипиновый скрининг - IgG/IgM – cуммарных) проведено методом иммуноферментного анализа набором ORGENTEC (Германия), антиовариальных антител – BIOSERV Diagnostics (Германия), опухолевоассоциированного антигена СА-125 – DRG (Германия). Все анализы проведены на многофункциональном счетчике для иммуноферментных исследований с программным обеспечением Victor (Finland). С целью оценки состояния эндокринного статуса репродуктивной системы обследуемых пациенток проводилось определение концентрации уровня гормонов в плазме крови и перитонеальной жидкости - стероидных гормонов: эстрадиола, прогестерона, тестостерона; тиреоидных – Т3, Т4; белковых: гликопротеинов - ЛГ, ФСГ, ТТГ, лептина, активина, а так же полипептида – пролактина. Концентрацию гормонов определяли в первую фазу менструального цикла иммуноферментным методом с использованием иммуноферментных тест – систем EIA-DRG (Germany) по прилагаемым протоколам. Определение NO, NOS в сыворотке крови и перитонеальной жидкости. Эндогенный уровень оксида азота в форме нитрит-аниона (NO-) определяли с помощью реактива Грисса (Н.П.Дмитренко и соавт., 1998). Активность нитрооксидсинтазы (NOS) измеряли по увеличению продукции оксида азота из L- аргинина в присутствии NADPH (D.J.L.Julio et al., 1995). Генетические исследования Проведено обследование 115 человек. В группу больных вошли женщины, проходящие лечение по поводу эндометриоза в стационаре ФГУ «РНИИАП Росмедтехнологий» (41 пациент) в 2007-2008 гг. В контрольную группу (74 пациента) были включены недавно родившие женщины, у которых не было эндометриоза в анамнезе. Большинство пациенток были русскими (29 пациенток с НГЭ и 70 без него). Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в набором DIAtom™ DNA Prep100 по рекомендации фирмы производителя («Центр Молекулярной генетики» Россия). Генотипирование локусов GSTT и GSTM проводили с помощью коммерческой тест-системы фирмы «Центр Молекулярной генетики» (Россия). Определение аллельных вариантов генов GPIIIα и Cyp19 проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами для молекулярно-генетического анализа разработанными ГосНИИгенетика (Москва). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при помощи программируемых термоциклеров «ДНК-Технология» (Москва) и «PTC-220» (MJ Research, США) по программе, рекомендованной производителем набора. Статистическая обработка данных при генетическом исследовании. Определение достоверности различий между сравниваемыми группами или подгруппами по частотам генотипов и аллелей исследуемых генов производили с помощью критерия Фишера (для количества наблюдений меньше 20 и значения частот меньше 5) или хи-квадрат по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений (Бочкарев П.Н. и соавт. 2004; 2005). Значение р<0,05 было принято как статистически значимое. Величину относительного риска OR (odds ratio), выражающего силу ассоциаций рассчитывали по стандартной методике (Бабич П.Н. и соавт, 2005). Если значение OR=1, это свидетельствует об отсутствии различий между сравниваемыми группами. Статистический анализ полученных результатов проводился с использованием программ Microsoft Excel 2002 SP-2 (Microsoft Corporation, США) и Fisher_Exact (ссылка скрыта.). Математические методы анализа данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ Office 2003, Statistica 6.0. При статистической обработке цифрового материала нормальность распределения определялась по критерию согласия Пирсона. В случае подтверждения нормальности распределения и однородности дисперсий анализ по выявлению различий между средними значениями параметров в различных группах выполнялся с помощью t- критерия Стьюдента. Результаты оценивали статистически значимыми при р<0,05. Для исследования переменных, имеющих неоднородную дисперсию или распределение, отличное от нормального, применяли U-критерий Манна-Уитни (Г.Ф.Лакин, 1990; И.В.Гайдышев, 2001; О.Ю.Реброва, 2003). Проводилась оценка показателей общей статистики, медианы (квартиль 50%), квартили 75% и 25%. Различие между средними значениями параметров считалось достоверным, если значение р-уровня для данных переменных оказывалось меньше 0,05. При проведении корреляционного анализа данных применялся критерий Пирсона в случае нормального распределения переменных и критерий Спирмена в противном случае, при этом уровень значимости выбирался равным 0,05. Построение графиков и диаграмм осуществлялось с помощью пакета Statistica 5.1 и программы Microsoft Office Excel 2003.