Ивановский Государственный Университет Биолого химический факультет Кафедра физиологии человека и животных диплом

Вид материала

Диплом

Содержание Глава 2 Материалы и методы исследования. 2. 2 Характеристика исследуемых МЭ. Болезнь Кешана Болезнь – Кашин - Бека (Уровская болезнь) 2. 2. 2 Кобальт. 2. 3 Методика проведения эксперимента. 2.4 Методика определения микроэлементного состава головного мозга белых крыс. Таблица 1 Параметры разложения по методу «мокрого озоления» биосубстратов головного мозга (этапы 1 –5) Таблица 2 Параметры разложения по методу «мокрого озоления» биосубстратов мозга (этапы 6 – 10) 2.5 Методика статистической обработки результатов.

Подобный материал:

• М. К. Аммосова биолого географический факультет институт физической культуры и спорта, 137.1kb.
• Программа аттестационных испытаний по биологии биолого-химический факультет, 524.84kb.
• Биолого-химический факультет, 247.38kb.
• Биолого-химический факультет, 241.34kb.
• Роль индивидуальных психофизиологических особенностей студентов в адаптации к умственной, 674.31kb.
• Тверской Государственный Университет Химико-Биолого-Географический факультет Кафедра, 103.37kb.
• Время и место проведения Конференция проводится в апреле 2012 года в Нижегородском, 41.09kb.
• Перспективное планирование мероприятий на основе данных анализа дтп, по обеспечению, 34.73kb.
• М. В. Ломоносова филологический факультет кафедра истории зарубежной литературы Диплом, 949.48kb.
• Дагестанский Государственный Университет Юридический факультет Кафедра гражданского, 1143.65kb.

Глава 2 Материалы и методы исследования.

2. 1 Цели и задачи исследования.

Минеральные вещества, наряду с витаминами и другими биологически активными веществами, являются обязательными элементами, обеспечивающими нормальное течение процессов жизнедеятельности человека и животных (Ю. Ф. Крылов, 2001).

Экспериментальные исследования В.С. Райцеса (1981), С.Ю. Штрыголя (2000), клинические работы М. Antoni (1995) и R. A. Goyer (1995), показали, что без гарантированной нормализации баланса МЭ и МаЭ другие действия (курсы лекарств или витаминов) недостаточны или безуспешны, т.к. деформированный минеральный обмен не только вносит свой вклад в патогенез нервных заболеваний, но и изменяет формакокенитическое действие вазоактивных препаратов, ноотропов, нейропротекторов и других лекарств.

При лечении заболеваний ЦНС широко используются нейропептиды и элемент содержащие препараты, которые оказывают благоприятное действие на течение заболеваний (Л. А. Громов, 1992).

Чаще эти препараты вводятся внутривенно или внутримышечно. В настоящее время для получения лучших результатов лечения эти препараты стали вводиться интраназально.

Интраназальное введение лекарственных средств относится к парентеральному типу введений (Н. П. Елинов, 2003).

Интраназально хорошо всасываются только липидорастворимые вещества. Подслизистое пространство носа имеет прямой контакт с субарахноидальным пространством обонятельной доли мозга. Этот путь


29

чаще используют для препаратов, влияющих на ЦНС (В. И. Гузева, И. Б. Михайлов, 2002).

Эффективность этого метода введения элементсодержащих препаратов заключается в том, что на слизистой носа отсутствуют ферменты расщепляющие нейропептиды, также наблюдается хорошее всасывание МаЭ и МЭ, которые в комплексе с нейропептидами обеспечивают быстрый транспорт нейротрофической композиции в мозг (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001).

При парентеральном введении лекарств их биодоступность во многом зависит от скорости преодоления ГЭБ (Н. П. Елинов, 2003). ГЭБ – динамически функционирующая мембрана между кровью и мозгом регулируемая самим мозгом (В. И. Гузева, И. Б. Михайлов, 2002). ГЭБ не играет какой – либо заметной роли для проникновения молекул воды, углекислого газа и кислорода, свободно проникающих через капилляры мозга (Н. П. Елинов, 2003), при этом глюкоза и аминокислоты преодолевают его при помощи специальных носителей, которые синтезируются эндотелием для инсулина существуют специальные рецепторы, которые захватывают, а затем интернализуются и освобождают эти вещества в интерстициальное пространство мозга (В. И. Гузева, И. Б. Михайлов, 2002).

Как показал анализ литературных данных, раствор сульфата цинка и церебролизин широко используются в клинике для лечения различных заболеваний чаще всего внутримышечно, внутривенно, перорально (Е. Д. Жуковская, 1990; О. А. Громова, 2001). Отсутствие работ отражающих влияние интраназального введения церебролизина и сульфата цинка, а также их совместного влияния на микроэлементный состав и его изменение в структурах головного мозга белых крыс, побудили нас к проведению данного исследования.


30

В связи с этим целью нашей работы является изучение интраназального введения церебролизина и сульфата цинка на микроэлементный состав головного мозга белых крыс.

В соответствии с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать методику интраназального введения лекарственных средств;

2. Исследовать МЭ состав различных структур головного мозга у здоровых животных;

3. Изучить МЭ состав головного мозга белых крыс после 10 – ти дневного совместного введения церебролизина и сульфата цинка;

4. Изучить МЭ состав головного мозга белых крыс после 20 – ти дневного последовательного введения церебролизина и сульфата цинка;

5. Выявить отличие в МЭ составе головного мозга белых крыс при различной форме введения препаратов.


31


2. 2 Характеристика исследуемых МЭ.

Патология человека и животных, обусловленная дефицитом эссенциальных МЭ, а также их избытком, дисбалансом МаЭ и МЭ получила объединенное название микроэлементозов (А. П. Авцын, А. А. Жаворонков, Л. С. Строчкова, 1983).

В настоящее время принято подразделять МТОЗы на 2 основные группы: гиперМТОЗы, возникающие при избыточном поступлении в организм МЭ, и гипоМТОЗы, развивающиеся при дефиците эссенциальных МЭ. Если первые в большей мере известны медикам, то вторые изучены не достаточно (А. П. Авцын, А. А. Жаворонков, М. А. Риш, Л. С. Строчкова, 1991). ГипоМТОЗы можно определить как патологическое состояние, обусловленное дефицитом содержания в организме эссенциальных МЭ. «Установление эссенциальности многих МЭ, и в частности значение их недостаточности представляет собой вопрос биологии и медицины, решение которого не уступает по значению открытию витаминов (А. П. Авцын, 1990).

Уровень дефицита некоторых эссенциальных МЭ, таких в частности, как Zn, Cu, Fe, Se, довольно широко распространен в мире, в том числе даже в развитых странах США, Германия, Франция и др (А. П. Авцын, А. А. Жаворонков, 1991; I. Bernat, 1983)

Существенный прогресс в изучении эссенциальности МЭ и открытии новых жизненно важных МЭ связан с разработкой оригинальных хронических экспериментов моделирующих конкретные гипоМТОЗы у лабораторных животных в течении, длительного времени (более года) на специальном полусинтетическом пищевом рационе, сбалансированным по МЭ составу. Это стало возможным благодаря появлению коммерческих очищенных аминокислот, разработке высокочувствительных методов анализа МЭ в биологических средах тканях, а также применение специальных пластиковых клеток – изоляторов, исключающих возможность

32

поступления МЭ в организм животного из окружающей среды. Эти мероприятия позволили экспериментально доказать принадлежность к эссенциальным ряда новых МЭ в частности Li, As, Ni, V, Co и др (M. Antoni, 1995; R. A. Goyer, 1995).

2. 2.1 Селен.

Последнее время интерес ученых вызывают состояния связанные с избытком, недостатком или дисбалансом МЭ в организме человека. Один из наиболее и мало изученных элементов – селен, который проявляет как токсические, так и эссенциальные свойства (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001). Он играет важную роль в возникновении патологических реакций организма, особенно при его дефиците (Е. В. Печенникова, В. В. Вашкова, Е. А. Можаев, 1997).

Селен это химический элемент 4 группы периодической системы Д. И. Менделеева, атомный номер 34, атомная масса 78,96, неметалл. Элемент открыт в 1817 г И. Я. Берцелиусом (В. Г. Ребров, 2003).

Элемент существует в условиях биологических систем в переменных валентностях. Биологическая роль селена у млекопитающих, включая людей, приписана присутствию селеноцистеина в каждом из четырех каталитических участках селенозависимых ферментов (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001). Все основные многогранные эффекты селена: антиапоптическое, противовирусное, антибактериальное, противоопухо левое, противовоспалительное и антистрессорное обусловлены экспрессией многочисленных селенозависимых ферментов (Л. В. Аникина, 2002).

Наиболее важным ферментом является семейство глутатионперо ксидазы (ГП). ГП – 1 клеточная форма (найдена во всех клетках организма), локализуется в цитозоле, образует основное депо селена в организме. ГП – 2 характерна только для эпителия ЖКТ, синтезируется в печени, в ободочной кишке, осуществляет защиту от оксидантов поступающих с пищей. ГП – 3 межклеточная изоформа фермента контролирует уровень перекисей вне

33

клетки. ГП – 4 локализуется в основном в семенниках, но небольшая фракция присутствует в мембране и в цитозоле. Играет очень важную роль в репродукции у мужчин. ГП – 6 специфическая, изоформа фермента экспрессируется в мозге (В. Г. Ребров, 2003). ГП, компонентом которой является селен разрушает образовавшиеся при ПОЛ эндоперекиси, образующиеся из ненасыщенных жирных кислот (Р. Беркоу, Э. Флетчер, 1997; А. В. Скальный, 2000). Витамин Е и селен действуют на различные звенья этого процесса, поэтому при их сочетании дозу каждого можно уменьшить (В. Г. Кукес, 1999).

В малых дозах селен обнаружен в ядрах клеток, в составе ЭПС клетки, где система цитохрома Р – 450 особенно важна для окисления экзогенно поступающих веществ (В. Г. Ребров, 2003; О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001).

Селен содержащие белки могут быть разделены на 3 группы (Arthur et al, 1993):

1. Белки, содержащие, неспецифически инкорпорированный селен;

2. Белки, специфически связывающие селен;

3. Белки, содержащие Se – Cys .

Антиканцерогенные эффекты селена, опосредованы через действие селеносодержащих белков. Эти эффекты селена могут блокироваться антогонистическими компонентами и элементами. Для максимального антиканцерогенного эффекта применение селена должно быть начато как можно раньше и продолжаться пожизненно (В. Я. Тутельян с соавторами, 2001).

Антионкологическая (лечебная) доза селена выше средне суточной потребности в элементе. Защита от рака может вовлекать один или более селенозависимых ферментов. Поэтому для предотвращения рака индивидуумы даже с нормальным потреблением селена могут нуждаться в селеновых препаратах (В. Г. Ребров, 2003). Известно, что в жизнеспособной

34

опухолевой ткани концентрация селена в 5 – 10 раз больше, чем в некротизированной (А. П. Авцын с соавторами, 1991). Показано, что селен, может непосредственно стимулировать активность естественных киллеров (ЕК), тем самым, подавляя ЕК – чувствительные опухоли и стимулируя ЕК резистентные линии неоплазий. Селен, способен косвенно, через стимуляцию продукции ИЛ–1 и ИЛ–2 повышать активность противоопухолевых клонов ЕК (J.D.Wallach,1990). Механизм противоопухолевого, действия селена, основан на включении этого МЭ в состав селенопротеинов, которые способны ингибировать ДНК – И РНК – нуклеотидилтрансферазы, инвелируя амплификацию опухолевого генома (А. В. Кудрин, А. В. Скальный, 2000).

Селен наряду с антиоксидантами (витамин Е, эндогенные и экзогенные флавоноиды, катехины) блокирует оксидацию липопротеидных частиц (Л. В. Аникина, 2002).

Селен участвует в метаболизме гормонов щитовидной железы, т.к. является компонентом дейодиназ семейства селеноэнзимов. Особенно важная роль принадлежит дейодиназе 2–го типа, катализирующей активирующееся дейодирование Т4 с образованием Т3, тем самым модулируя наличие Т3 в отдельных тканях (М. В. Велданова, 2000).

Селен защищает организм от нитратов и нитритов, обладающих канцерогенными и эмбриотоксическим действием (В. П. Дерягина с соавторами, 1996).

А. Bargellini с соавторами (1995) показал, что селен обладает способностью активировать иммунитет, обусловленный лимфоцитами крови. Эта способность, как показали исследования, зависит не только от дозы и времени воздействия селена, но и от вида изучавшегося в эксперименте его соединения. Активность клеток ЕК угнеталась при их инкубации с селенитом натрия и возрастала при инкубации с селенометионином. При этом критическая концентрация селена, при которой возможно пороговое

35

повышение или понижение активности ЕК (лимфоцитов) составляла 394,5 мкг/л.

Пищевой дефицит селена приводит к значительному снижению активности селенозависимых ферментов в многочисленных тканях эпителиального, железистого и лимфоидного происхождения. Но в мозге активность селенозависимых ферментов сохраняется на относительно стабильном уровне, даже в условиях глубокого дефицита селена, в силу существования уникальной селентранспортной системы ЦНС (белки депонирующие селеноцистеин, селентранспортный белок аппарата Гольджи и др). В мозге экспрессия отличается наиболее разнообразной популяцией селен содержащих белков. Баланс селена играет значительную роль в нейротрансмитерном обмене стриополидарной системы (продукции дофамина и NO) и продукции миелина олигодендроцитами. Селен в составе селенсодержащих белков (белок Р, W, ГП, низкомолекулярных селеновых белков) сохраняется в условиях дефицита МЭ. Очевидно, что данное явление следует рассматривать как приобретенную в ходе эволюции защитную реакцию мозга в ответ на относительно не стабильное потребление данного элемента с пищей (В. Г. Ребров, 2003).

Оценивая цитоархетектонические особенности распределения селена в головном мозге, необходимо отметить его преимущественную аккумуляцию в области сосудистых сплетений мозга, а также гипоталамо – гипофизарной и лимбической систем (В. Я. Тутельян с соавторами, 2001).

Необходимость селена для организма была выявлена в Китае 1979 при изучении этиологии и патогенеза кардиомиопатии, которая затем была определена, как селен дефицитная (В. Г. Ребров, 2003).

В тех регионах где имеется глубокий селенодефицит т.е. потребление селена в суточной дозе ниже в 2 – 2, 5 раза наблюдаются такие заболевания как болезнь Кешана и Кашин – Бека (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001).


36

Болезнь Кешана – это эндемическая кардиомиопатия, которая наиболее часто встречается в тех районах, где отмечено низкое содержание селена в почве, а, следовательно, в растениях, выращенных на ней. Долгое время считалось, что дефицит селена единственная причина развития данного заболевания. В настоящее время доказано, что причина заболевания энтеровирусная инфекция (cox sackivirus B3) на фоне глубокого селенодефицита и недостаточного поступления кальция с пищей (Beck et al, 1998). Болеют преимущественно дети 2 – 7 лет и женщины фертильного возраста.

Для болезни Кешана характерны аритмии, увеличение размеров сердца, фокальные некрозы миокарда, за которыми следует сердечная недостаточность. Иногда наблюдаются признаки тромбэмболии. У взрослых основные патологические изменения представлены мультифокальным некрозом миокарда с фиброзным перерождением, фокальный биллинарный цирроз (50%), тяжелый лобарный цирроз (5%), повреждение скелетных мышц (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001).

Определяются низкие концентрации селена в цельной крови, сыворотке крови, моче. Заболевание имеет высокий процент летальности (J. D.Wallach et al, 1990).

Болезнь – Кашин - Бека (Уровская болезнь) – это эндемическая остеопатия, поражающая преимущественно детей в возрасте 6 – 13 лет (пик заболеваемости приходится на 8 лет), но могут поражаться люди от 4 до 55 лет. В группе подростков мальчики страдают в 2 раза чаще девочек.

Начало заболевания постепенное. Появляется слабость, сопровождающаяся болью в суставах с нарушением их подвижности. Первыми обычно поражаются межфаланговые суставы. Реже – тазобедренные и плечевые суставы. Возможны поражения грудинно реберных сочленений. В пораженных суставах отмечается утолщение суставных концов; хруст, определяемый рукой или слышимый на

37

расстоянии; возможно образование свободных внутрисуставных тел. Покровы и ткани, окружающие сустав остаются без изменений. В тяжелых случаях движения в суставах затруднены. По мере увеличения продолжительности болезни, увеличивается число заболевших суставов, прогрессируют анатомические изменения, ухудшается функция сустава, но к алкилозу не приводит (Л. П. Никитина, В. Н. Иванов, 1995). Дефицит селена возникает не только при низком поступлении, но и при хронической интоксикации тяжелыми металлами при заболеваниях печени, а также при лечении фенилкетонурии парентеральным и полусинтетическим питанием (В. Г. Ребров, 2003).

Дефицит селена ускоряет развитие атеросклероза, ишемической болезни сердца, существенно повышается риск возникновения инфаркта миокарда (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001). Отмечена взаимосвязь между дефицитом селена и витамина Е с возникновением синдрома внезапной «колыбельной» смерти у детей. Плацентарная недостаточность, бактериальное потребление селена (Escherichia coli), во время беременности угнетают тириоидную функцию плода, что в дальнейшем может привести к внезапной «колыбельной» смерти (J. Kvikala et al, 1995).

С дефицитом селена связан патогенез вирусных заболеваний (СПИД, гепатит В, рак, грипп) (Cowgill, 1997).

Дефицит внутриклеточного селена в жировой ткани, может способствовать развитию ожирения за счет торможения мобилизации жиров. Дефицит селена в эндокринных железах может способствовать эндокринопатии и в частности, гипофизарной недостаточности (Z. R. Arthur et al, 1993).

При недостатке селена одним из первых клинических проявлений могут быть шелушение эпидермиса и выпадение волос вплоть до, полного облысения (В. И. Таболин, М. Ф. Дещекина, 1983).


38

При избытке селена общая клиническая симптоматика полиморфна. Наблюдается поражение кожи (хронические дерматиты), волос (выпадение), ногтей (расслаивание ногтевой пластинки), зубов (повреждение эмали) (В. Г. Ребров, 2003). У человека при избыточном поступлении селена в организм развиваются симптомы острого отравления: тошнота, утомляемость, раздражительность, боли в животе, чесночный запах дыхания и пота (выделение селена в виде газообразного диметилселенида), металлический вкус во рту, бронхопневмонии, изменения ЭКГ, гипербилирубинэмия (Gasmi et al, 1997). Кроме того, наблюдаются артриты, анемии, нервные расстройства (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001).

Суточная потребность в селене зависит от возраста. Данные представлены в таблице.

Таблица

Суточная потребность селена в зависимости от возраста.

(В. Г. Кукес, 1999).

возраст	суточная потребност селена, мкг	Возраст	суточная потребност селена, мкг	возраст	суточная потребност селена, мкг
до 6мес	10 – 40	1 –3 года	20 – 80	7 – 15 лет	50 – 100
6 –12 мес	20 – 40	4 – 6 лет	30 – 10	старше 15 лет	50 – 100

В среднем она составляет 20 – 100 мкг (А. В. Скальный, 1999 а, б). Селен антогонист ртути (T. Kauf et al, 1994; Mussalo Rauhamo et al, 1996), поэтому защищает организм от ее токсического действия (R. A. Goyer, 1997), а кроме этого кадмия (M. Szillagyi et al, 1996), свинца, мышьяка, таллия (В. А. Книжников, и др; А. В. Скальный, 2001), железа, ванадия (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001).

39

Препараты селена являются весьма перспективными в фармакотерапии заболеваний мозга. Одним из препаратов обладающих первентивной активностью при сосудистых поражениях мозга и находящимся на переригистрационной стадии в Японии как средство лечения церебральной ишемии и субарахноидальных кровоизлияний является Эбселен (В. Г. Ребров, 2003).

Из организма селен элеминируется тремя основными путями: через почки, кишечник и выдыхаемый воздух. Но в большинстве экспериментов и клинических наблюдений установлено, что в физиологических условиях гомеостаз селена, регулируется в основном экскрецией этого элемента с мочой (Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова, 2001).

Суммирование известных в мировой литературе данных о нейрохимических эффектах селена, приведено в монографии О. А. Громовой и А. В. Кудрина (2001) «Нейрохимия макро – и микроэлементов», в монографии В. Я. Тутельяна с соавторами (2002) «Селен в организме человека. Метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе».

1. Селен регулирует, антиоксидантные процессы в ЦНС; (В. Я. Тутельян, 2001).
   
2. Селен потенциирует мозгоспецефические эффекты йода в процессе органогенеза в период внутриутробного развития. Креацинизм у новорожденных следствие комбинированного дефицита селена и йода (А. П. Авцын, 1991).
   
3. Выступает ингибитором апоптоза, предупреждая нейродегене ративное поражение мозга при БА и БП, прионовых болезнях (Ronai et al, 1996).
   
4. Является антиишемеческим и антиогенным фактором (В. Г. Ребров, 2003).
   
5. Тормозящий фактор при аутоиммунных процессах (неврологические нарушения при системных заболеваниях соединительной ткани, рассеяный склероз) (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001).
   

40

6. Выполняет противоопухолевые функции при карциномах эпителиального происхождения (глиомы, нейробластомы) через реализацию апоптоза опухолевых клеток (Л. В. Аникина, 2002).
   
7. Играет роль антогониста нейротоксичных металлов и мышьяка, в том числе путем реализации антиканцерогенных и антимутагенных свойств. Назначение микродоз селена элиминирует канцерогенный и гипотоксический эффекты апоптогенных металлов: кадмия, ртути, свинца и др (А. В. Скальный, А. В. Кудрин, 2000).
   

Таким образом, селен проявляет уникальные биологические свойства и является эссенциальным микроэлементом при осуществлении разнообразных функций, включая деятельность мозга, процессы репопуляции нейронов, и нейропротекции и формировании формакотерапевтической реакционной способности. Без коррекции селенового гомеостаза невозможно добиться ожидаемых терапевтических эффектов от применяемых нейротропных средств.

2. 2. 2 Кобальт.

Кобальт химический элемент 8 группы периодической системы Д. И. Менделеева, атомный номер 27, атомная масса 58,94, металл белого цвета с красноватым оттенком (В. Г. Ребров, 2003).

Жизненная необходимость кобальта была установлена в ходе эндемических исследований КРС и проявляется у человека перцинозной анемией (болезнь Адисона – Бирмера).

В последние годы появились новые данные о роли кобальта в нейропротективных механизмах. С одной стороны, кобальт может стабилизировать разнообразные рецепторы, в частности элемент потенциирует адрено – и норадренодитические эффекты (М. Antoni, 1995). Комплекс кобальта с АТФ оказывает антигипоксическое и нейропротекторное действие при диффузной хронической церебральной

41

ишемии в экспериментальной модели на кроликах страдающих гипертензией (В. С. Райцес, 1981). С другой стороны, кобальт при поступлении в цитоплазму нейронов активирует так называемый фактор, индуцирующий гипоксию – 1. Данный транскриптационный фактор играет значительную роль в процессе антистрессорной защиты мозга, предупреждении апоптоза и механизмах клеточного цикла и роста нейронов (М. Bergeron, 2000).

Исследование Е. Д. Жуковской (1997), выявили увеличение содержания, Со, Cu, Ni в мозге (особенно в затылочной доле, мозжечке, зрительном бугре) и тенденцию к снижению концентрации их во внутренних органах детей с ДЦП (умерших от пневмонии), при повышении содержания кальция и натрия.

Отклонения в обмене кобальта обнаружены при эндемическом Виллюйском энцефалите, поражающим исключительно коренное население Якутии (якуты, эвенки, эвены). При заболевании имеет место дисбаланс МаЭ и МЭ: наряду с дефицитом кобальта у больных имеется дефицит кальция, магния, селена и избыток содержания натрия, калия, железа, хрома в организме больных (А. В. Скальный, 2000).

Дефицит кобальта был описан в Шотландии в начале 60–х годов у грудного ребенка, проживающего в биогеохимической провинции с недостатком этого элемента. Заболевание сопровождалось геофагией и улучшением состояния при лечении кобальтом (А. П. Авцын, 1991).

При дефиците кобальта наблюдались выраженные изменения в иммунокомпетентных органах, прежде всего в тимусе. Здесь имели место морфологические признаки акцидентальной инволюции (О. В. Заратьянц, 1991).

У экспериментальных животных при недостатке кобальта наблюдалось развитие как доброкачественных, так и злокачественных опухолей. Последние были различной локализации (кожа, молочная железа, матка) (Л. А. Жаворонков с соавторами, 1997).

42

Дефицит кобальта в организме чаще всего связан с заболеваниями органов пищеварения – атрофическим гастритом, различными формами энтерита, сопровождающиеся синдромом малоабсорбции. При дефиците наблюдается дегенерация ЦНС и ПНС, дистрофия костей, учащение аллергии немедленного типа: возникает мегалобластическая анемия. Дефицит кобальта может также провоцировать развитие эндемического зоба, поскольку он необходим для нормального синтеза тироксина; отмечается нарушение жирового обмена, проявляется жировым гепатозом, иногда с наклонностью к развитию цирроза печени (В. Г. Ребров, 2003).

При дефиците кобальта могут беспокоить слабость, утомляемость, нарушение чувствительности, нарушение в работе сердца, хронические рецидивирующие инфекции, у детей – замедление развития (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001).

Избыток кобальта при контактном воздействии вызывает гиперкератоз кожи, хронический бронхит, интерстициальный фиброз легких. Резорбтивные действия характеризуются – гиперлипидемией артериальной гипотонией, миокардиопатией. Избыток кобальта блокирует тириоидперксидазу, вызывает гипотириоз и гиперплазию щитовидной железы (А. В. Скальный, 2000).

Кобальт – составная часть цианкобаламина. Он необходим для осуществления двух ферметативных реакций: синтезом метионина из гомоцистеина; для повторного образования тетрагидрофолиевой кислоты из метилфолата (т.е. кобальт способствует обмену фолата и синтезу тимедина) и превращение метилмаланина в сукцинил – КоА, необходимый для утилизации углеродонасыщенных жирных кислот (В. С. Райцес, 1981).

В составе цианокобаламина в организме человека усваивается 1/10 – 1/12 часть кобальта. Кроме того, организму необходим неорганический кобальт для включения в фермент глицилглициндипептидазу и стимуляция эритропоэза. Соединения кобальта оказывают не только гемостимулирующее

43

действие, но и изменяют физико – химические свойства эритроцитов. Высказана гипотеза, что, кобальт, стимулирует гемопоэтическую ткань по средством образования эритропоэтина (Ю. И. Москалев, 1985).

Дефицит цианокобаламина, наиболее выражен в местах быстрого деления клеток, например в кроветворных тканях костного мозга и нервной системы, что выражается в дегенерации нервных волокон спинного мозга и периферических нервов. При недостаточности цианокобаламина нарушается образование кроветворных клеток. В место нормальных клеток в косном мозге могут возникать мегалоблаты, что приводит к развитию анемии. Образование мегалобластов связано с нарушением синтеза ДНК. Доказательством участия кобальта в гемопоэзе является воспроизведение с помощью его солей истинной полицитемии у животных. Полицитемия возникает в результате повышения кобальтом скорости образования эритроцитов более быстрого полихроматофильного созревания базофильных нормобластов и выхода зрелых эритроцитов в кровь (О. А. Громова, 1997).

Кобальт – составная часть молекулы витамина В12, недостаток которого наиболее ощутим в местах быстрого деления клеток, например, в кроветворных тканях косного мозга, в органах иммунной системы, нервных тканях, в коже и слизистых оболочках. Наиболее характерными проявлениями дефицита кобальта являются: анемия; деградация косного мозга; дегенеративное изменение в спинном мозге; нарушение функции нервной системы – депрессия, расстройство сна, ухудшение памяти; заболевание эндокринной системы; нарушение менструального цикла; гиперпигментация кожи. (В. Г. Ребров, 2003).

Витамин В12 входит в состав S – аденозилметионин – В12 – метилтрансфераза, который участвует в процессе метилирования ДНК и липидов, входящих в состав миелинового вещества (А. В. Скальный, 2000). Физиологические дозы кобальта обладают гипотензивным, коронаролитическими свойствами, а лекарственные препараты кобальта

44

могут предупреждать развитие дегенеративных изменений нервной системы, применяются при анемиях в том числе железодефицитных или для стимуляции иммунологической активности. Известны следующие медикаментозные препараты, содержащие, ион кобальта: коамид, ферковен, кобальтамин, эритрофилин, мотавин (Ю. Ф. Крылов, 2001).

Кобальт предотвращает развитие анемии и должен поступать в организм из пищевых источников. Белковая пища способствует усвоению кобальта. У строгих вегетарианцев существует большая вероятность появления дефицита кобальта в сравнение с теми, кто включает в свой рацион мясо, рыбу, устриц, крабов. Кобальт и витамин В12 полезны лицам, подвергающимся повышенным физическим нагрузкам, спортсменам, т.к. витамин В12 обладает анаболическим эффектом – способствует увеличению мышечной массы и ускоряет процессы физического восстановления. Лекарственные препараты, содержащие кобальт, способствуют усвоению железа и оказывают благоприятное влияние на иммунологическую реактивность организма. Дневная норма кобальта не установлена и только очень малые количества этого минерального вещества нужны в рационе – обычно не более 8 мкг (В. Г. Ребров, 2003).

Наибольшее содержание кобальта наблюдается в орехах (фундук, грецкий) более 10 мкг, наименьшее содержание кобальта в рисе и молочных продуктах менее 1 мкг (В. Я. Тутельян, 2001).

Из организма кобальт экскретируется с мочой (О. А. Громова, А. В. Кудрин, 2001).

Таким образом, кобальт в организме проявляет разнообразные свойства, которые подтверждают то, что он действительно является эссенциальным МЭ (т.е. необходим организму).


45

2. 3 Методика проведения эксперимента.

Эксперименты проведены на 24 беспородных крысах - самцах массой 180+ 2, 6 г, которые содержались в изолированных клетках по 6 особей в каждой на стандартном рационе при свободном доступе к воде. Схема эксперимента представлена на рисунке 1.

Все животные были разделены на 2 большие группы по 12 особей в каждой. 1- ю группу составили контрольные животные, которые были разделены на 2 подгруппы: 1 – я подгруппа интактные животные (6 особей) без лечения, 2 – я подгруппа – животные, получавшие и/н дистиллированнную воду. 2 –я группа экспериментальные животные (содержащая 12 особей). Она была разделена на 3 – ю и 4 – ю подгруппы по 6 особей в каждой . Животные из 3 – ей подгруппы в течении, 10 – ти дней получали

и/н совместно ЦБ и раствор сульфата цинка 0,12 М в дозе 3мл/кг по одной капле в каждую ноздрю с перерывом 10 минут за 1 – 2 часа. 4 – ой подгруппе сначала в течении, 10 –ти дней и/ н вводили раствор сульфата цинка(0,12 М)в дозе 3 мл/кг по одной капле в каждую ноздрю с перерывом 10 минут за 1 – 2 часа, а затем 10 – ть дней вводили, и/н ЦБ в дозе 3 мл/кг по 1 капле в каждую ноздрю с перерывом 10 минут за 1 – 2часа (рис. 1).

ЦБ для настоящего исследования был предоставлен компанией «Evebe» (Австрия), а цинка сульфат сверхвысокой чистоты (99,9%) фирмой «Sigmа» (США).

На 11 – й и 21 - й день эксперимента соответственно животные получали нембуталовый наркоз, подвергались декапитации и по стандартной методике извлекали головной мозг. Его помещали в чашки Петри, после чего брали срезы кусочков ткани мозга толщиной 1 – 1,5 мм из трех областей центральной извилины лобной доли коры, гипоталамуса, обонятельных луковиц (2). Эти образцы сохраняли в промаркированных пакетах и замора

47

живали при температуре 18 – 20 до проведения масс - спектрометричекого исследования. С помощью этого метода определяли содержание селена и кобальта в тканях головного мозга.

Полученные результаты подвергались статистической обработке с целью установления достоверности наблюдаемых различий.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программы Mikrosoft Exel с определением средней ошибки полученных данных. Достоверность данных оценивали с помощью Т – критерия Стьюдента.


48

2.4 Методика определения микроэлементного состава головного мозга белых крыс.

Дальнейшие исследования проводились в Центральной лаборатории судмедэкспертизы г. Москвы по исследованию МаЭ и Мэ состава полученных образцов. Благодаря О. А. Громовой нам предоставилась возможность определить содержание МЭ в образцах биообъектов на совершенном оборудовании, которое было предоставленно лабораторией судмедэкпертизы г. Москвы. Этот прибор - индукционно – плазменный масс – спектрометр характеризуется высокой чувствительностью, возможностью селективного детектирования и одновременного получения необходимой информации о структуре компонентов биопробы и позволяет успешно проводить количественное определение МаЭ и МЭ.

Перед тем как анализировать МаЭ и МЭ состав полученных биообьектов с помощью индукционно – плазменного масс – спектрометра, они были разложены по методу «мокрого озоления». Сначала образцы были высушены при температуре 105 С в течении 6 часов в сушильном шкафу. После этого было проведено взвешивание на аналитических весах Perkin Elmer AD – 6 Auto balance с точностью до 1 мг. Навески материала переносили в автоклавы (тефлоновый сосуд Весселя) и добавляли 1 мл 70% НNO3 (OC4), прошедший вторичную перегонку, затем автоклав помещался в микроволновую систему пробоподготовки МД – 2000 фирмы СЕМ (США) обеспечивающее высокое давление и температуру кипения HNO3. Параметры разложения (метод «мокрого озоления») приведены по этапам в таблицах 1 и 2.


49

Таблица 1

Параметры разложения по методу «мокрого озоления» биосубстратов головного мозга (этапы 1 –5)

этап	1	2	3	4	5
% prower	50	50	50	50	0
PSI	40	80	120	160	0
Time	10	10	10	25	0
Tap	5	5	5	15	0
Fan speed	100	100	100	100	100

После охлаждения образца в течении, 10 минут в автоклав добавили 1 мл Н2О2 (ОС4) продолжили процесс разложения по параметрам представлены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры разложения по методу «мокрого озоления» биосубстратов мозга (этапы 6 – 10)

Этап	6	7	8	9	10
% Power	60	0	0	0	0
Psi	150	0	0	0	0
Time	20	0	0	0	0
Tap	5	5	5	15	0
Fan speed	100	100	100	100	100

После охлаждения полученных растворов в течении, 60 минут от них были отобраны аликвоты в объеме 1 мл в пластиковые сосуды и разбавлены в 5 раз бидистиллированной и деионизированной водой. Для контроля чистоты анализа был приготовлен раствор «холостой пробы» с содержанием


50

HNO3, H2O2, H2O в пропорциях идентичных содержанию этих реагентов в исследуемых образцах.

Описанная выше методика пробоподготовки с использованием СВЧ нагрева в тефлоновых «бомбах» позволяет проводить быстрое «вскрытие» биопробы, избежать потерь летучих элементов (мышьяк, селен), с высокой эффективностью разложить биологическую матрицу, влияющую на результаты анализа.

В качестве внутреннего стандарта в растворы вводили индий в концентрации 25 мкг/л. Калибровочные растворы были приготовлены из стандартных растворов фирмы VTRC c известным содержанием в диапазоне от 5 до 1000мкг/ л. Полученные растворы анализировались на масс – спектрометре с ионизацией в индуктивно - связанной плазме «VG Plasma Quod PQ 2 Turbo» (Англия), рабочая мощность СВЧ генератора 1,3кВтб, расход плазмообразующего газа (аргон) 14 л/мин расход транспортирующего газа 0,89 мл/мин. Проводились 3 экспозиции каждого образца, время интегрирования сигнала 60 сек, Результаты анализа «холостой пробы» автоматически вычитались в анализе. Единицы измерения ррв (мкг/кг) (Г. Зейлер, 1993; Х. И. Зильберштейн, 1971).


51

2.5 Методика статистической обработки результатов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью Т – критерия Стьюдента. Закон Т – распределения служит основой так называемой теории малой выборки, которая характеризует распределение выборочных средних в нормально распределяющейся совокупности в зависимости от объема выборки. Т – распределение зависит только от числа степеней свободы К= n-1, при чем с увеличением объема выборки, Т – распределение быстро приближается к нормальному с параметрами м=1 и =1 и уже при n>30 не отличается от него.

Т – распределение симметрично и отражает специфику распределения средней арифметической (Х) в случае малой выборки в зависимости от ее объема (n). Для выборок объем, которых превышает 30 единиц, величина Т – распределения нормально и не зависит от числа наблюдений. Если же n<30, характер Т – распределения зависит от числа наблюдений. Для практического использования Т – распределения составлена специальная таблица (см. таб. 5 приложений Г. Ф. Лакин, 1990), в которой содержатся критические точки(t st) для разных уровней значимости L и числа степеней свободы К.

Для определения достоверности различий между показателями микроэлементов опытной и контрольной групп вычисляли следующие величины:

Х к – средняя арифметическая контрольной группы;

Х о – средняя арифметическая опытной группы;

S хк, Sхо – ошибки средних арифметических.

Фактическое значение Т – критерия Стьюдента вычисляли по формуле:

Тф= d/Sd, где (1)

D – разность средних арифметических;

Sd – ошибка разности средних арифметических.

52


T st находят по таблице «критические точки Т – критерия Стьюдента» при различных уровнях значимости L для К = n-1, где К – число степеней свободы, а n – объем выборки.

Если tф>t st, то Ho – принимается и различия между выборочными средними являются не достоверными, p>0,05(0,001 или 0,01). tФ