Молекулярно-генетические методы и компьютерные технологии в системе эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями 14. 00. 30 эпидемиология 03. 00. 06 вирусология
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Мониторинг микробиоценозов влагалища в системе эпидемиологического надзора при инфекционно-воспалительных, 633.15kb.
- Мониторинг микробиоценозов влагалища в системе эпидемиологического надзора при инфекционно-воспалительных, 642.63kb.
- Эпидемиологического надзора за малярией, 514.35kb.
- Нормативно-методическая и законодательная база деятельности государственного санитарно-эпидемиологического, 55.14kb.
- Модели эволюции. Генетические алгоритмы, 361.44kb.
- Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным, 3372.01kb.
- Дудина кристина Рубеновна хроническая hвv-инфекция: молекулярно-генетические методы, 574.63kb.
- Приказ Первого заместителя председателя Агентства Республики Казахстан по делам здравоохранения, 601.07kb.
- Доклад Управления Роспотребнадзора по Республике Коми об осуществлении государственного, 688.51kb.
- План основных организационных мероприятий управления федеральной службы по надзору, 3516.32kb.
ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ГЛПС
С целью оценки информационных возможностей молекулярно-генетических методов при этиологической расшифровке заболевания, дифференциации возбудителя, идентификации источника инфицирования, эти методы применялись при исследовании биологического материала во время подъёмов заболеваемости ГЛПС в отдельных регионах РФ.
Изучение заболеваемости ГЛПС в Удмуртской Республике. Удмуртия занимает одно из первых мест по заболеваемости ГЛПС в РФ. В 2004 г. в Республике был зарегистрирован очередной подъём заболеваемости - заболело около 2 тысяч человек, при этом интенсивный показатель составлял 127 на 100 тысяч.
Методом ПЦР был исследован материал от 67 человек, госпитализированных в Республиканскую инфекционную больницу г. Ижевска с предварительным клиническим диагнозом ГЛПС. В результате лабораторных исследований методом ПЦР диагноз ГЛПС был подтвержден у 53 человек, НМФА – у 52 больных. У 14 пациентов первичный диагноз ГЛПС был признан ошибочным и впоследствии был снят на основании отсутствия сероконверсии и отрицательных результатов ПЦР.
Все 53 положительные пробы, полученные в ПЦР, были секвенированы. В результате филогенетического анализа было установлено, что заболеваемость ГЛПС в Удмуртской Республике в 2004-2005 гг. была обусловлена геновариантами вируса Пуумала, большая часть которых (48 РНК-изолятов) представляла собой монофилитическую группу со средним уровнем нуклеотидных отличий 1,8%.
Было обнаружено, что 5 образцов выбивались из общей когорты новых «Удмуртских» геновариантов. При этом 3 РНК-изолята отличались от большинства в среднем на 7%, кластеризовались в одну подгруппу вместе со штаммами, выявленными ранее в Республике Башкортостан. Один РНК-изолят был дистанцирован от общей группы на 12,5 % и был близок к геновариантами из Липецкой и Воронежской областей, от которых отличался всего на 0,5%. Ещё один РНК-изолят отличался от остальных на 20,5%, при этом была выявлена его генетическая близость к группе «Омско-Тюменских» штаммов, от которых он отличался в среднем на 0,4 %.
Основываясь на данные филогенетического анализа можно предполагать, что заражение 5 человек, постоянно проживающих в Удмуртии, произошло на территории других регионов, скорее всего 3 человека заразились во время выезда в Республику Башкортостан, 1 человек во время визита в Тюменскую область и 1 во время посещения Центральной полосы России.
Изучение заболеваемости ГЛПС в Оренбургской области. ГЛПС является чрезвычайно актуальной инфекцией для населения Оренбургской области. По уровню заболеваемости за последние 10 лет область занимает 4-е место среди субъектов Приволжского федерального округа. До 1995 года на территории области выделяли активные природные очаги ГЛПС лесного типа (Бугурусланский плакорно-лесной, Бузулукский пойменно-боровой и Зилаирско-Сакмарский пойменно-лесной), характерные для вируса Пуумала.
В 2005 году в области произошёл очередной подъём заболеваемости (1288 случаев, с показателем на 100 тыс. населения - 59,7), при этом случаи ГЛПС были зарегистрированы в тех районах, которые ранее считались эпидемиологически благополучными по данной инфекции. Учитывая участившиеся в последние годы случаи ГЛПС, ассоциированные с вирусом Добрава, не исключалась гипотеза, что заболевания ГЛПС, зарегистрированные на остепнённых территориях области, могут быть связаны с этим вирусом.
Для получения дополнительной информации о хантавирусах, циркулирующих на территории Оренбургской области, были проведены молекулярно-генетические исследования полевого и клинического материала, полученного из эпидемически активных очагов ГЛПС в 2006-2007 гг.
Методом ПЦР были исследованы клинические пробы от больных ГЛПС и пробы от грызунов, отловленных на территории 6 районов области.
В ходе анализа 42 клинических проб методом ПЦР было выявлено 14 положительных результатов. При исследовании 33 образцов полевого материала РНК хантавирусов была выявлена в 14 случаях. В результате секвенирования положительных проб определена принадлежность новых РНК-изолятов к вирусу Пуумала. В результате филогенетического анализа была установлена высокая гомогенность новых геновариантов вируса Пуумала, выявленных как в полевом, так и в клиническом материале из 6 исследованных районов. Средний уровень отличий РНК-изолятов, полученных от людей и грызунов из этих районов, составил 0,3%.
Исключением являлся образец № 33, отличавшийся от всех остальных в среднем на 6,5%. РНК-изолят, полученный из этого клинического образца, кластеризовался в одну группу вместе со штаммами вируса Пуумала из Башкирии. Проведённое в этой связи ретроспективное эпидемиологическое расследование показало, что больной (№33) является по профессии вахтовым рабочим и более 20 дней в месяц проводит в Республике Башкортостан, в связи с чем мог легко заразиться ГЛПС именно в том регионе.
Судя по всему, формирование новых активных очагов в остепнённых районах области происходит за счёт расширения ареала вируса Пуумала, локализация которого ранее была тесно связана с лесными провинциями. Активизация Бузулукского пойменно-борового и Зилаирско-Сакмарского пойменно-лесного очагов обусловливают расширение их границ и приводят к увеличению заболеваемости ГЛПС в районах, ранее считавшихся благополучными по данной инфекции.
Предположение об участии вируса Добрава, в качестве дополнительного этиологического агента вызывающего заболеваемость ГЛПС в Оренбургской области, в ходе молекулярно-генетических исследований не подтвердилось.
Изучение вспышки ГЛПС в Центральном Черноземье. По данным Роспотребнадзора РФ в последние годы наблюдается активизация природных очагов ГЛПС и устойчивая тенденция роста заболеваемости практически во всех субъектах Центрального федерального округа.
В декабре 2006 года произошло резкое обострение эпизоото-эпидемиологической обстановки по ГЛПС в Центральном Черноземье. Наибольшее количество заболевших отмечалось в Воронежской и в Липецкой областях, где с декабря по март было зарегистрировано 442 случая ГЛПС. При этом пик интенсивности эпидемического процесса (90% заболевших) был отмечен в декабре-январе (2006-2007 гг.).
В ходе расследования вспышки были выявлены характерные особенности, обусловленные её смешанной этиологией. Было установлено, что зарегистрированные в этот период случаи ГЛПС были связаны с вирусами Добрава и Пуумала, при этом 88,5 % заболеваний были обусловлены вирусом Добрава. Среди заболевших доминировало сельское население и лица трудоспособного населения. Заражение людей происходило преимущественно воздушно-пылевым путём, при уборке сена, загрязнённых экскрементами грызунов помещений, а также в ходе выполнения сельскохозяйственных работ. Заболеваемость мужчин и женщин не имела статистически достоверной разницы.
Очевидные различия были выявлены в соотношении городских и сельских жителей, инфицированных разными вирусами. Среди заболевших ГЛПС, заразившихся вирусом Пуумала, наблюдалось практически одинаковое соотношение городских и сельских жителей, тогда как среди заболевших, инфицированных вирусом Добрава, превалировало сельское население (90%).
На долю сельскохозяйственного и бытового эпидемиологических типов заражения, обусловленных вирусом Пуумала, приходилось 58%, также значительное число случаев инфицирования людей (42%) происходило во время во время охоты и посещения леса. В структуре заболеваемости ГЛПС, связанной с вирусом Добрава, было выявлено явное преобладание бытового и сельскохозяйственного эпидемиологических типов заражения (94%), остальные случаи заражения людей (6%) были связаны с посещением леса, охотой или производственной деятельностью.
В результате проведённых молекулярно-генетических и эпидемиологических исследований было сделано заключение, что основными носителями патогенного вируса Добрава и источниками хантавирусной инфекции, вызвавшей вспышку ГЛПС, явились преимущественно полевые мыши. Об этом свидетельствовали высокий уровень их инфицированности (до 67%), а также высокое генетическое сходство РНК-изолятов Добрава, выявленных от полевых мышей и больных людей.
Таким образом, в ходе выполнения данного этапа работы была показана эффективность использования молекулярных методов, с высокой результативностью выявляющих возбудителей ГЛПС как в полевом, так и клиническом материале, а также продемонстрированы информативные возможности разработанных методик для решения ряда эпидемиологических задач. К разряду наиболее важных проблем, возникающих в ходе изучения заболеваемости ГЛПС, относятся этиологическая расшифровка, дифференциация хантавирусов, постановка и верификация диагноза, происхождение возбудителя и предполагаемый регион (область) заражения. Как было показано, в ходе настоящей работы все перечисленные задачи успешно решались с помощью разработанных молекулярно-генетических методик.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ ХАНТАВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ГЛПС, ФОРМИРУЮЩИХ ПРИРОДНЫЕ ОЧАГИ ИНФЕКЦИИ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Для изучения генетической гетерогенности популяций хантавирусов нами была использована технология прямого секвенирования ампликонов, полученных в результате ПЦР с универсальными S- и М- праймерами. Информативность выбранных фрагментов генома для последующего филогенетического анализа была оценена в результате теоретических и экспериментальных исследований.
В ходе работы из клинического и полевого материала были выявлены около 300 новых РНК-изолятов хантавирусов, отнесенных к видам Добрава, Пуумала и Тула.
Характеристика популяций вируса Пуумала, циркулирующих на территории РФ. С использованием молекулярно-генетических методов нами были выявлены и генетически охарактеризованы новые геноварианты вируса Пуумала из природных очагов, расположенных в Самарской, Оренбургской, Воронежской, Тюменской, Омской областей, в Республиках Удмуртии и Башкортостан. В ходе филогенетического анализа новых РНК-изолятов Пуумала, а также на основе информации о штаммах этого вируса, изолированных ранее на территории РФ и зарегистрированных в базе данных GenBank, были выделены четыре самостоятельные группы – «Волго-Уральская», «Центральная», «Сибирская» и «Карельская» (рис. 2).
В «Волго-Уральскую» группу вошли геноварианты, выявленные нами в в Самарской и Оренбургской областях, в Республиках Башкортостан и Удмуртия (рис. 2). Уровень различий между РНК-изолятами из этих регионов варьировал в пределах от 3,6 до 7%, тогда как внутри каждого региона они отличались в среднем на 0,7-2,5%. Вирусные штаммы, относящиеся к «Волго-Уральской» группе, характеризуются широкой областью распространения на территории РФ. Можно сказать, что почти 90% всех зарегистрированных случаев ГЛПС в России, связаны с геновариантами именно этой группы.
Рисунок 2. Филогенетический анализ новых геновариантов вируса Пуумала по фрагменту гена N (426 н.) с помощью программы Mega, метода сравнения Neighbor-Joining. Новые РНК-изоляты, выявленные нами в различных регионах РФ, отмечены маркёрами
Между тем, заболеваемость ГЛПС, связанная с вирусом Пуумала, отмечаемая в Центральном, Сибирском и Северо-Западном федеральных округах РФ, по всей вероятности, связана с геновариантами, которые ходе филогенетического анализа были отнесены к «Центральной», «Сибирской» и «Карельской» группам. Недостаточная изученность этих штаммов не позволяет оценивать эпидемический потенциал природных очагов, в которых они циркулируют.
Средний уровень нуклеотидных отличий между геновариантами перечисленных выше 4 групп варьировал в пределах от 14 до 22 %.
В ходе анализа фрагментов аминокислотных последовательностей N гена были обнаружены гипервариабельные регионы, которые могут выступать в качестве молекулярных маркёров для внутривидовой дифференциации штаммов Пуумала.
Для большинства штаммов из Республики Башкортостан, Самарской и Оренбургской областей маркёрной является аминокислотная последовательность (позиции 258- 274) – QEVEFLKRNRVYFMTRQ. Анализ этого фрагмента показал наличие от 1 до 6 замен у штаммов из других регионов: для «Удмуртских» штаммов - QEIEFLKRNRVYFMTRQ, для «Тюменских» штаммов - QEVEMLKKNKIYFMHRQ, для «Омских» штаммов - QEIEMLKKNKIYFMHRQ, для «Воронежских» – QEVEFLKRNRVYFMNRQ.
Дополнительными маркерами для внутривидовой дифференциации штаммов Пуумала могут служить аминокислотные последовательности в позиции 299-307. Для штаммов, отнесённых к «Волго-Уральской» группе, маркёрной является SPDDIESPN; для «Омско-Тюменских» штаммов характерна SPDNIDSPN последовательность. Обнаружено, что фрагмент аминокислотной последовательности PERIREFMEK (позиции 232-241), консервативный для большинства штаммов Пуумала, позволяет дифферецировать штаммы внутри «Волго-Уральской» группы. Для штаммов из Республики Башкортостан маркёрной служит последовательность PEKIREFMEK, для «Удмуртских» штаммов – PERIRDFMEK; для «Самарских» и «Оренбургских» штаммов характерна последовательность PERIREFMER.
В ряде случаев для геновариантов, выявленных из клинических проб, была отмечена значительная генетическая дистанцированность от общей массы РНК-изолятов, обнаруженных в конкретном регионе. В результате филогенетического анализа РНК-изолятов для некоторых больных из Удмуртской Республики и Оренбургской области были предварительно определены возможные места их инфицирования, которые характеризовались удалённостью от постоянных мест проживания этих людей.
Очевидно, что обнаруженные молекулярные маркёры могут быть также использованы для эпидемиологического анализа. Например, вирусный РНК-изолят, полученный от больного № 33 из Оренбургской области, имел маркёрную последовательность характерную для «Башкирских» штаммов – PEKIREFMEK. В 3 РНК-изолятах (Izh/508-Hs/04, Izh/542-Hs/04, Izh/566-Hs/05), выявленных от больных из Удмуртской Республики, был обнаружен маркёр QEVEFLKRNRVYFMTRQ вместо характерного для большинства «Удмуртских» штаммов - QEIEFLKRNRVYFMTRQ.
Характеристика популяций вируса Добрава, циркулирующих на территории РФ. Проведённый филогенетический анализ позволил выделить генетически и географически отличающиеся группы – «Центральную», «Южную» и «Западно-Сибирскую», в которые вошли новые РНК-изоляты вируса Добрава (рис. 3). В «Центральную» группу были отнесены РНК-изоляты, выявленные нами в Липецкой, Воронежской, Курской и Тамбовской областях. С геновариантами этой группы были ассоциированы недавние вспышки ГЛПС в Центральном Черноземье. В ходе филогенетического анализа внутри «Центральной» группы были определены 3 самостоятельные субгруппы – «Воронежско-Липецкая», «Липецко-Тамбовская» и «Курская» (рис. 3). Несмотря на географическую близость штаммов этой группы, обнаружена их значительная генетическая дистанцированность - средний уровень межгрупповых отличий составлял 10,5 %. При этом уровень различий между геновариантами внутри каждой субгруппы варьировал в диапазоне 0,5-1,5 %.
Рисунок 3. Филогенетический анализ новых геновариантов вируса Добрава по фрагменту гена G2 (275 н.) с помощью программы Mega, метода сравнения Neighbor-Joining. Новые РНК-изоляты, выявленные нами в различных регионах РФ, отмечены маркёрами
В «Южную» группу вошли РНК-изоляты выявленные от грызунов, обитающих на территории Астраханской области и в Республике Калмыкия. К «Западно-Сибирской» группе были отнесены вирусные РНК-изоляты, обнаруженные нами в грызунах на территории Омской области. Недостаточная изученность геновариантов Добрава, циркулирующих в этих регионах, не позволяет сделать заключение о границах ареала и эпидемическом потенциале природных очагов этих вирусов.
Уровень нуклеотидных различий между геновариантами «Центральной», «Южной» и «Западно-Сибирской» групп в среднем составляет 9,5-11%. Установлена значительная дистанцированность всех РНК-изолятов, входящих в эти группы, от российских штаммов Добрава, циркулирующих в Краснодарском крае; при этом средний уровень отличий от них составляет 19-22%.
Анализ фрагментов аминокислотных последовательностей G2 гена позволил выявить молекулярный маркёр для внутривидовой дифференциации штаммов Добрава. Для «Астраханских» РНК-изолятов в позиции 421-427 маркёрной служит последовательность AEQESTQ, которая отличается от последовательности VEQESTQ, являющейся характерной для большинства новых геновариантов Добрава, выявленных нами. Кроме того, установлено, что аминокислотные замены в этой области VEQDSEQ являются характерными для классических штаммов Dobrava-Belgrade.
Таким образом, информацию, полученную в результате генотипирования хантавирусов, можно считать эпидемиологически значимой. Данные о гетерогенности популяций вирусов Добрава и Пуумала представляют особую важность при определении эпидемического потенциала природных очагов ГЛПС и оценки уровня опасности новых штаммов для человека.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА
ЗА ПРИРОДНЫМИ ОЧАГАМИ ГЛПС НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ
Изучение циркуляции хантавирусов на территории Липецкой области началось в 2002 году сразу после возникновения первой зарегистрированной вспышки ГЛПС. Ретроспективно было установлено, что с ноября 2001 г. по март 2002 г. заболели 65 человек (в 8 районах области), при этом средний показатель варьировал от 2,7 до 57 на 100 тысяч (рис. 4). В течение последующих 4-х лет заболеваемость в этом регионе носила спорадический характер с ежегодной регистрацией от 2 до 10 случаев в год. В конце 2006 года эпидемическая ситуация по ГЛПС вновь осложнилась. Всего с декабря 2006 г. по март 2007 г. было зарегистрировано 243 подтвержденных случаев ГЛПС в 9 из 18 районов области; показатель заболеваемости варьировал в пределах от 5,5 до 448 на 100 тысяч населения (рис. 4). Максимальные уровни заболеваемости отмечались в двух районах области – Добринском и Усманском.
Рисунок 4. Показатели заболеваемости на 100 тыс. населения во время вспышек ГЛПС в Липецкой области
С целью изучения особенностей циркуляции хантавирусов исследовались пробы от людей и грызунов из различных районов Липецкой области.
С помощью молекулярных технологий была выявлена генетическая неоднородность популяций вируса Добрава, циркулирующих на территории Липецкой области. Установлено, что геноварианты из Добринского и Усманского районов формируют 2 хорошо выделенные на филогенетическом дереве субгруппы – «Добринск-Тамбов» и «Усмань-Воронеж» (рис. 5).
Рисунок 5. Гетерогенность популяций вируса Добрава, циркулирующих на территории Липецкой области
Уровень различий между РНК-изолятами этих групп в среднем составлял 9%. В то же время геноварианты, выявленные от грызунов и людей в пределах одного и того же района, не отличались между собой более чем на 0,5-2%.
Дальнейший анализ показал, что «Усманские» РНК-изоляты из Липецкой области кластеризовались вместе с геновариантами, изолированными от больных людей и грызунов из Воронежской области (рис. 5). РНК-изоляты из Добринского района Липецкой области были генетически близки к геновариантам вируса Добрава, выявленными от грызунов, обитающих на территории Тамбовской области (рис. 5).
Кроме того установлено, что в районах, расположенных в южной части области, преимущественно на территории Усманского района, одновременно циркулируют два патогенных хантавируса – Добрава и Пуумала.
На основе проанализированной информации можно сделать заключение - в настоящее время на территории области сформировались автономные природные очаги ГЛПС, имеющие свои характерные особенности, что необходимо учитывать при дальнейшем мониторинге, прогнозировании заболеваемости и проведении профилактических мероприятий.
В ходе работы была сформирована база данных «ГЛПС в Липецкой области», предназначенная для картографического анализа накопленной информации с помощью ГИС-технологии. Одна из поставленных задач заключалась в определении эпидемического потенциала природных очагов и проведении эпидемиологического районирования территории Липецкой области. Для этой цели впервые была адаптирована и апробирована аналитическая программа ГИС «КОМПАС».
Картограммы, полученные в ходе анализа отобранных информационных показателей таких как – показатели заболеваемости на 100 тысяч, уровень инфицированности грызунов, количество населённых пунктов в каждом районе, в которых регистрировались случаи ГЛПС, и число лет регистрации заболеваемости в каждом районе, наглядно отражают проявления эпидемической активности природных очагов ГЛПС в Липецкой области в течение анализируемого периода с 2002 по 2007 гг. (рис. 6).
Для оценки интенсивности эпидемических проявлений (ИЭП) ГЛПС в каждом районе за анализируемый период (2002-2007 гг.) использовали показатель, рассчитанный нами с помощью формулы:
ИЭП = N × P : Z,
где N – сумма лет регистрации случаев ГЛПС у людей, P – количество поражённых населённых пунктов, Z - число календарных лет анализируемого периода.
По показателю ИЭП все районы области были ранжированы по шкале (от 0 до 25,5). В результате проведённого группирования с учётом сходства показателей, была получена картограмма, отражающая разделение территории в соответствии с уровнем интенсивности эпидемических проявлений (рис. 7).
Рисунок 6. Анализ эпидемических проявлений ГЛПС в районах Липецкой области в течение 2002-2007 гг.
На основе данных, полученных в ходе молекулярно-эпидемиологических исследований, а также результатов анализа значимых критериев с помощью программы ГИС, было проведено эпидемиологическое районирование территории Липецкой области. В итоге все районы области были ранжированы по категориям - высокого, среднего и низкого риска заражения ГЛПС.
Добринский и Усманский районы, на территории которых с помощью молекулярно-генетических и иммунологических методов была установлена интенсивная циркуляция геновариантов хантавирусов Добрава и Пуумала, а также отмечались максимальные показатели ИЭП, были отнесены к зоне высокого риска заражения (рис. 7).
ИЭП: 5.02 25.50 (2 района)
ИЭП: 2.03 5.01 (3 района)
ИЭП: 0.12 2.02 (8 районов)
ИЭП: 0.00 0.11 (5 районов)