Дудина кристина Рубеновна хроническая hвv-инфекция: молекулярно-генетические методы диагностики, оптимизирующие тактику ведения пациентов

Вид материала

Документы

Содержание Научный консультант Шахгильдян Иосиф Васильевич Беляева Наталья Михайловна Никитин Игорь Геннадьевич Бурцева Елена Ивановна Цель исследования Задачи исследования Основные положения, выносимые на защиту Научная новизна Практическая значимость Апробация работы, публикации и внедрение в практику Личный вклад автора Структура и объем диссертации Содержание диссертации Рисунок 1. Доля лиц с нормальной и повышенной активностью Рисунок 8. Частота выявления варианта генетического риска развития неблагоприятного исхода у пациентов с различной активностью т Практические рекомендации Список сокращений Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Подобный материал:

• Модели эволюции. Генетические алгоритмы, 361.44kb.
• Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным, 3372.01kb.
• Молекулярно-генетические методы и компьютерные технологии в системе эпидемиологического, 615.43kb.
• Пособие для пациентов Москва 2009, 178.23kb.
• Анкета участника, 37.12kb.
• Л. И. Параллелизмы в молекулярной организации генома и проблемы эволюции. В кн.: Молекулярные, 251.18kb.
• План лекции: /Кремень В. Е./ Анаэробная инфекция (определение, классификация); Анаэробная, 253.28kb.
• 1 Структурно-логическая схема дисциплины «Антикризисное управление», 27.25kb.
• «Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных, 460.33kb.
• Ультразвуковые методы диагностики в невропатологии и нейрохирургии детского возраста, 1897.14kb.

На правах рукописи


ДУДИНА

Кристина Рубеновна


ХРОНИЧЕСКАЯ HВV-ИНФЕКЦИЯ:

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ,

ОПТИМИЗИРУЮЩИЕ

ТАКТИКУ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ


14.01.09 - инфекционные болезни


А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук


Москва - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный

медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения

и социального развития Российской Федерации


Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Ющук Николай Дмитриевич


Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, Шахгильдян Иосиф Васильевич

доктор медицинских наук, Руководитель лаборатории эпидемиологии, диагностики профессор и профилактики вирусных гепатитов

ГОУ ВПО НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского

Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, Беляева Наталья Михайловна

профессор Заведующая кафедрой инфекционных болезней

ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, Никитин Игорь Геннадьевич

профессор кафедра госпитальной терапии лечебного факультета

ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И. Пирогова

Минздравсоцразвития России


Ведущее учреждение – Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России.


Защита диссертации состоится «17» октября 2011 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России (123 098, Москва, ул. Гамалеи, 16).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России


Автореферат разослан « »___________________ 2011 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

Актуальность проблемы


Хронический гепатит В продолжает оставаться социально-значимой проблемой мирового здравоохранения и является одной из основных причин формирования ЦП и ГЦК, которые ежегодно в мире приводят к летальному исходу более, чем у 1 миллиона человек [Bosch F.X. et al., 2005]. Анализ заболеваемости вирусными гепатитами в России показал, что по сравнению с 90-ми годами, в России с 2001 года наблюдается отчётливая тенденция к снижению заболеваемости острым вирусным гепатитом В, благодаря проведению массовой вакцинации населения в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье» и борьбе с наркоманией. Однако, в течение последнего десятилетия показатель заболеваемости ХГB удерживается на прежнем уровне. Современной эпидемиологической особенностью гепатита В является доминирование полового пути передачи инфекции и изменение возрастного состава заболевших: общее число больных приходится на долю лиц в возрастных группах 19-29 и 30-39 лет, среди которых вакцинацию, как правило, не проводили. Таким образом, в настоящее время распространение HBV реализуется естественными путями передачи, такими как половая и перинатальная [Письмо от 4 марта 2011 г. N 01/2390-1-32. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Минздравсоцразвития России; Шахгильдян И.В. и др., 2006; Шахгильдян И.В. и др., 2011].

Клинические проявления и исходы хронической HBV-инфекции во многом определяются взаимодействием HBV и макроорганизма, а именно, факторами вируса (генотипы HBV, уровень репликации HBV, рекомбинации и мутации вируса) и макроорганизма (возраст на момент инфицирования, давность инфицирования, пол, иммунный статус), а также - экзогенными факторами (ко-инфицирование другими гепатотропными вирусами, употребление алкоголя) [McMahon B.J., 2004; Fattovich G. еt al., 2008; EASL 2009].

В последнее десятилетие изучается влияние генетической вариабельности HBV на течение и исход заболевания. С помощью методов секвенирования появилась возможность определения различных генотипов и мутантных форм вируса HBV отличающихся низким уровнем репликации, латентным характером течения инфекции, более активным поражением печени. В последнее время появляются данные, указывающие на то, что генотип HBV может влиять на скорость НВе-сероконверсии, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития ГЦК. С разными генотипами HBV связывают различные варианты манифестации заболевания и ответ на лечение у больных хронической HBV-инфекцией [Feld J.J., Heathcote E.J., 2006; Hadziyannis S.J, Papatheodoridis G.V., 2006; EASL, 2009]. Под вопросом остается корреляционная связь между генотипом HBV и уровнем репликации HBV, а также - степенью поражения печени и исходом заболевания.

В последние годы внедрение молекулярно-генетических методов исследования в клиническую практику позволило улучшить диагностику ХГВ и выделять хроническую HBV-инфекцию с высокой и низкой репликативной активностью HBV. Проведенные за последние 10 лет несколько крупномасштабных, длительных, проспективных когортных исследований выявили взаимосвязь между постоянно высоким уровнем виремии HBV и неблагоприятными исходами заболевания – ЦП и ГЦК [Yu M.W. еt al., 2005; Chen C.J. еt al, 2009]. Во многом благодаря этим исследованиям постоянно высокий уровень виремии HBV в настоящее время предлагается рассматривать в качестве одного из критериев назначения пациенту с хронической HBV-инфекцией ПВТ, целью которой является предотвращение неблагоприятных исходов заболевания путем снижения уровня виремии HBV до неопределяемого, так как вследствие этого происходит улучшение гистологической картины печени. До настоящего времени отсутствуют Российские национальные рекомендации по тактике ведения пациентов с хронической HBV-инфекцией. Однако, специалисты в России, обсуждая результаты международных исследований на научных конференциях, также отмечают целесообразность использования определения уровня вирусной нагрузки HBV при динамическом обследовании для выработки тактики ведения пациента.

Благодаря появлению коммерческих тест-систем, позволяющих выявлять количественное содержание HBsAg в крови, в настоящее время активно изучается клиническое значение данного показателя. Часть работ, посвященных определению количественного содержания HBsAg в крови, показали прямую корреляцию уровня виремии HBV с концентрацией HBsAg [Deguchi M. еt al., 2004; Wang GS, еt al., 2004]. Ряд других работ демонстрирует слабую корреляцию концентрации HBsAg с уровнем виремии HBV и различные диапазоны количественного содержания HBsAg в крови у больных НВе-позитивным и НВе-негативным ХГВ [Kuhns MC, еt al., 2004; Thompson A. J. еt al., 2009; Lu L. еt al., 2009; Thompson A. J. еt al., 2010].

До настоящего времени в России не проводились исследования, посвященные комплексному обследованию большой группы пациентов с хронической HBV-инфекцией, включающему динамическое определение уровней АлАТ и АсАТ в крови, виремии HBV, серологического уровня HBsAg, морфологическое исследование ткани печени в сочетании с генетической вариабельностью HBV и генетически детерминированным риском развития ЦП у человека. Данный диагностический подход может позволить разработать алгоритм и оптимизировать тактику ведения больных при многовариантном течении ХГВ. Учитывая имеющиеся нерешенные клинические проблемы, касающихся тактики ведения пациентов с хронической HВV-инфекцией, были сформулированы цели и задачи данного исследования.


ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: клинико-лабораторное обоснование использования молекулярно-генетических методов диагностики в совершенствовании тактики ведения больных с различными вариантами хронической HBV-инфекции и создание алгоритма действий врача при обследовании пациентов.


ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить клиническое и прогностическое значение комплекса диагностических методик, включающих определение уровня виремии HBV, концентрации HBsAg в крови при динамическом наблюдении пациентов с хронической HBV-инфекцией в сочетании с морфологическим исследованием пунктата печени и генетически детеминированным риском развития ЦП.
   
2. Определить особенности клинического течения хронической HBV-инфекции на фоне беременности с учетом уровня виремии HBV.
   
3. Определить уровень виремии HBV при динамическом наблюдении у пациентов с различными вариантами течения хронической HBV-инфекции (НВе-позитивный ХГВ, НВе-негативный ХГВ, неактивное носительство HBV).
   
4. Сопоставить показатели уровня активности АлАТ и АсАТ в крови, виремии HBV и морфологические характеристики ткани печени у пациентов с различными вариантами хронической HBV-инфекции для выявления больных с показаниями к назначению ПВТ.
   
5. Провести сравнительный анализ результатов оценки фиброза печени инвазивным и неинвазивным методами диагностики у пациентов с хронической HBV-инфекцией для оценки доли больных с прогрессирующим течением заболевания (F ≥ 2).
   
6. Определение количественного содержания HBsAg в крови у неактивных носителей HBV и пациентов с различными вариантами течения ХГВ при динамическом наблюдении.
   
7. Изучить генетическую вариабельность HBV с помощью методов ПЦР и MALDI-TOF масс-спектрометрии, а также - распределение выявленных генотипов HBV у пациентов с различными вариантами течения хронической HBV-инфекции.
   
8. Определить предикторы риска развития ЦП у больных ХГВ на основе анализа полиморфизма 11 кандидатных генов (AZIN1, TLR4, TRPM5, SNP4 (rs2290351), SNP5 (rs4290029), SNP6 (rs17740066), AQP2, ADH1B, ALDH2, CYP2E1-taqI, CYP2E1-pstI) человека c помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии.
   
9. Усовершенствовать алгоритм по тактике ведения пациентов с различными вариантами хронической HBV-инфекции в зависимости от комплекса диагностических критериев: степени риска формирования ЦП на основе данных генетического анализа, геноварианта HBV, динамики уровня виремии HBV, концентрации HBsAg в крови, биохимической активности гепатита, морфологических изменений ткани печени.
   

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Только комплексное обследование пациентов с хронической HBV-моноинфекцией, включающее динамическое определение уровней активности АлАТ, количественного содержания ДНК HBV, HBsAg в крови, позволяет выявить пациентов с неактивным носительством HBV, а также – лиц, которым требуется проведение ПБП для уточнения диагноза и выявления показаний для назначения ПВТ.
   
2. У пациентов с хронической HBV-инфекцией, преимущественно, регистрируются низкие уровни виремии HBV в крови при динамическом трехкратном обследовании в течение 1,5 – 2-х лет, HBeAg-негативный вариант хронической HBV-инфекции и инфицирование генотипом D HBV.
   
3. Значимое повреждение печени (ИГА ≥ 6 и/или F ≥ 2), являющееся показанием для проведения ПВТ, выявляется у пациентов с хронической HBV-инфекцией, как на фоне отсутствия ДНК HBV в крови (при однократном обследовании), так и на фоне различного уровня виремии HBV (постоянно низкого, постоянно высокого и волнообразного), а также - при нормальной и повышенной активности АлАТ в крови.
   
4. При сравнительном анализе данных двух методов оценки фиброза печени (ПБП и ТФ), применяемых у пациентов с хронической HBV-инфекцией, выявлено, преимущественно, несоответствие результатов, а именно, в ряде случаев переоценка, а в большинстве случаев, недооценка стадии фиброза по данным ТФ при сравнении с результатами морфологического исследования биоптата печени.
   
5. Концентрация HBsAg в крови при хронической HBV-инфекции значительно варьирует, не коррелирует с уровнем виремии HBV у HBeAg-негативных пациентов в крови, снижается у большинства лиц с неактивным носительством HBV при трехкратном динамическом обследовании в течение 1,5 – 2-х лет, а у части из них - до минимальных значений с последующей сероконверсией (HBsAg«-»/анти-HBs«+»), что позволяет рекомендовать использование данного показателя в качестве дополнительного критерия благоприятного исхода хронической HBV-инфекции у лиц с нормальной активностью АлАТ в крови и авиремией HBV при динамическом обследовании.
   
6. Как у пациентов без признаков хронического диффузного поражения печени старше 50 лет и в отсутствии инфицирования HBV и HCV, так и у больных ЦП различной этиологии, преобладает частота выявления «неблагоприятных» вариантов аллелей генов AZIN1, TRL4 (rs4986791), TRPM5 (rs886277), SNP5 (rs2290351), AQP2 (rs2878771), CYP2E1-ptsI, определяющих генетическую предрасположенность к развитию неблагоприятного исхода ХЗП.
   
7. Выявление высокого и неопределенного генетически детерминированного рисков развития ЦП у подавляющего большинства больных ЦП вирусной, алкогольной и криптогенной этиологии, более частая регистрация низкого генетического риска ЦП у лиц с неактивным носительством HBV и его отсутствие в группе пациентов с неэффективностью ПВТ по данным анамнеза, позволяет рассматривать данный показатель как критерий возможного неблагоприятного исхода заболевания, что говорит о целесообразности определения генетического риска развития ЦП у кандидатов для назначения ПВТ.
   

НАУЧНАЯ НОВИЗНА


Впервые применено комплексное обследование пациентов с естественным течением хронической HBV-инфекции, включающее количественное определение уровня в крови ДНК HBV и HBsAg в сопоставлении с уровнем активности АлАТ, АсАТ в крови и оценкой степени воспалительной активности и стадии фиброза печени с помощью инвазивного и неинвазивного методов диагностики фиброза печени для уточнения диагноза.

Определение уровня виремии HBV у большой группы HBsAg-позитивных беременных женщин позволило уточнить вариант течения хронической HBV-инфекции и выявить в 3,5% случаев реактивацию HBV в третьем триместре беременности, характеризующуюся уровнем виремии 10⁵ – 10⁷ копий/мл на фоне высокой активности АлАТ и АсАТ (до 20 N).

Впервые получены данные о клиническом значении количественного содержания HBsAg в крови как дополнительного критерия неактивного носительства HBV у лиц с отсутствием детектируемого уровня ДНК HBV при динамическом обследовании с интервалом 6 - 12 месяцев в течение 1,5 - 2-х лет.

Выявлены данные о низком уровне количественного содержания HBsAg в крови у пациентов за 6-12 месяцев до сероклиренса HBsAg (в диапазоне от 15 до 600 МЕ/мл) и снижение минимальных концентраций поверхностного антигена в динамике наблюдения у неактивных носителей HBV.

При сопоставлении данных ПБП и ТФ показано, что, в большинстве случаев, регистрируется несовпадение результатов этих двух методов диагностики фиброза печени, как в виде недооценки, так и в виде переоценки неинвазивным методом диагностики стадии фиброза печени у пациентов с хронической HBV-инфекцией и обосновано предпочтение метода ПБП.

Впервые с использованием определения полиморфизма 7 кандидатных генов выявлены доли высокого, неопределенного и низкого генетически детерминированных рисков развития ЦП при вирусной, алкогольной и неизвестной этиологии данного заболевания, а также показано, что генетически детерминированный низкий риск развития ЦП чаще выявлялся у неактивных носителей HBV, чем у пациентов с другими вариантами течения хронической HBV-инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Показана целесообразность внедрения в практическое здравоохранение арсенала современных молекулярно-генетических методов, включающих количественное определение ДНК HBV, HBsAg, комбинацию инвазивной и неинвазивной диагностики фиброза печени, определение генетической вариабельности генома HBV и человека, что позволит уточнить диагноз пациенту с хронической HBV-инфекцией, прогнозировать исход заболевания и выбрать кандидатов для назначения ПВТ.
   
2. Обоснована необходимость включения в стандартный план обследования HBsAg-беременных женщин определение уровня виремии HBV методом ПЦР, что позволит контролировать течение хронической HBV-инфекции на фоне беременности и своевременно диагностировать её реактивацию.
   
3. Целесообразно использовать определение количественного содержания HBsAg в крови как дополнительный критерий диагноза неактивного носительства HBV при динамическом обследовании пациента.
   
4. Несмотря на широкое внедрение ТФ для неинвазивной диагностики фиброза печени, у пациентов с хронической HBV-инфекцией предпочтительно применять ПБП, а дальнейшее мониторирование выраженности фиброза печени возможно с применением ТФ.
   
5. У пациентов с НВе-негативной хронической HBV-инфекцией необходимо включить в план обследования определение генетических рисков развития ЦП: выявление высокого генетически детерминированного риска развития ЦП в сочетании с уровнем виремии HBV > 10⁴ копий/мл вне зависимости от уровня активности АлАТ в крови является дополнительным основанием для назначения ПВТ без необходимости выполнения ПБП.
   

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ, ПУБЛИКАЦИИ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ


Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России 26 мая 2011 г (протокол №108). Материалы диссертации доложены на Юбилейной XV научно-практической конференции «Клинические чтения в Мытищинской городской больнице. Инновационный университет практическому здравоохранению» (Мытищинская городская клиническая больница, 06 июня 2008); VI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 03.10.2008 г.), III конгрессе с международным участием «Российский Медицинский Форум 2008», посвященный 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва, 19.11.2008 г.), VII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 02.10.2009 г.), научно-практической конференции кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (Москва, протокол № 83 от 30.09. 2009 г.), Х Юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 05.03.2010 г.), II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2010 г.), VIII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 06.10.2010 г.), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2011 г.), научно-практической конференции ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (Москва, 28.04. 2011 г).

Основные положения диссертации изложены в 26 печатных работах, опубликованных в период с 2005 г. по 2011 г., из них - 12 в центральной печати, включая 1 монографию.

Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России на до- и последипломном уровнях образования врачей: включены в лекционный материал, разбираются на практических занятиях со студентами и врачами на курсах повышения квалификации. Предложенный алгоритм обследования пациентов с хронической HBV-инфекцией используется в практической работе на базе Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.


ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА


Личное участие автора в получении научных результатов заключалось в отборе пациентов в данное исследование, разработке дизайна исследования, изучении клинических, лабораторных и морфологических данных, характерных для течения хронической HBV-инфекции, изучении результатов генетического анализа, полученным от больных ЦП различной этиологии и лиц контрольной группы. Сформирован банк сывороток крови всех пациентов, включенных в исследование. Автором осуществлялось сопоставление результатов ТФ с данными ПБП. Выполнен статистический анализ полученных данных и проведено сопоставление результатов исследования с данными научной литературы.


СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ


Диссертация изложена на 348 страницах и состоит из введения, об­зора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 64 таблицами, 43 рисунками, 3 клиническими примерами. Список литературы содержит 345 источников, из которых 23 отечественных и 322 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объём, характер и методы проведённых исследований


В исследование включен 661 пациент, которых на основании клинико-лабораторных данных, полученных в ходе обследования, разделили на 5 групп: группа № 1 – 103 HBsAg-позитивные пациентки на различных сроках беременности (подгруппа 1а - «неактивные носители» HBV, n=43; подгруппа 1б – больные ХГВ без дельта-агента, n=43; подгруппа 1в – ХВГ смешанной этиологии, n=17 (11 больных ХГВ+Д; 4 пациентки с ХГВ+С; 2 пациентки с ХГВ+С+Д); группа № 2 – пациенты с хронической HBV-моноинфекцией, n=189; группа № 3 – пациенты с ХВГ смешанной этиологии, n=36; группа № 4 – больные ЦП различной этиологии, n=273 (подгруппа 4а - больные ХГВ с исходом в ЦП, n=40; подгруппа 4б - больные ХВГ смешанной этиологии с исходом в ЦП, n=33; подгруппа 4в - больные ХГС с исходом ЦП, n=117; подгруппа 4г - больные алкогольным ЦП, n=42; подгруппа 4д - больные криптогенным ЦП, n=41); группа №5 (контрольная группа) – 60 практически здоровых лиц старше 50 лет, из них 23 (38%) женщины и 37 (62%) мужчин; средний возраст пациентов данной группы составил 65,5 + 1,7 лет. Отбор пациентов в исследование осуществлялся в четырёх лечебных учреждениях г.Москвы, в которые обращались больные за медицинской помощью в 2006-2009 гг.

Критерии включения пациентов в исследование: выявление HBsAg (± другие маркеры вирусных гепатитов) на фоне нормальной и/или повышенной активности АлАТ и АсАТ в крови в течение 6 месяцев и более перед включением в исследование, возможность наблюдения за пациентами с ХВГ различной этиологии в динамике в течение 1,5 – 2-х лет (за исключением, пациенток на различных сроках беременности, которых обследовали однократно). Для оценки вклада полиморфизма генов человека в развитие ЦП в исследование также были включены пациенты возрастом не менее 18 лет с ЦП различной этиологии (HBV, ко-инфекция HBV с HCV и HDV, алкоголь, криптогенный ЦП), а также – пациенты контрольной группы с отсутствием маркеров вирусных гепатитов (HBsAg, анти-HCV в крови по данным методов ИФА и хемилюминесценции, ДНК HBV и РНК HСV в крови по данным метода ПЦР) и клинико-лабораторных признаков хронического диффузного поражения печени. Обязательным условием для включения в данное исследование было письменное информированное согласие пациента. Критерии исключения пациентов из исследования: наличие ВИЧ-инфекции, психических заболеваний и тяжелой соматической патологии; наличие в анамнезе сопутствующих заболеваний, требующих приём медикаментозной терапии и утяжеляющих течение ХГВ (гормональная, цитостатическая, иммуносупрессивная). Исключение данных критериев было необходимо для корректной трактовки клинической картины заболевания и результатов молекулярно-генетических исследований у пациентов с естественным течением хронической HBV-инфекции. В качестве основных методов обследования больных были применены:

- стандартные лабораторные: общеклинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи;

- серологический: определение маркеров хронических вирусных гепатитов В, С и Д с помощью коммерческих тест-систем методами ИФА и хемилюминесценции; антител к ВИЧ, CMV, HSV-1, -2, EBV, аутоантител (ANA, AMA) методом ИФА; дополнительно проводилось количественное определение HBsAg в крови методом хемилюминесценции с помощью коммерческой тест-системы «HBsAg Architect» фирмы «Abbott» на автоматическом анализаторе «Architect» (чувствительность – 0,05 МЕ/мл);

- инструментальные: УЗИ органов брюшной полости; ПБП с последующим морфологическим исследованием пунктата; транзиентная фиброэластография;

- молекулярно-генетический: определение РНК HAV, ДНК HBV, РНК HCV, РНК HDV, РНК HGV, ДНК TTV, ДНК CMV, ДНК EBV, ДНК HSV-1,2, ДНК HHV-6 в крови методом ПЦР в режиме реального времени (чувствительность - < 10³ копий/мл); количественное определение уровня виремии HBV методом ПЦР в режиме реального времени при помощи программного обеспечения «ABI prism 7000 SDS Software v1,0» на основании полученной в ходе реакции калибровочной кривой; генотипирование HBV с использованием реакции минисеквенирования с последующим определением продуктов реакции методом MALDI-TOF масс-спектрометрии; определение полиморфизма 11 генов человека с использованием технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Для анализа клинико-лабораторной картины хронической HBV-инфекции нами были выделены следующие диапазоны уровней виремии HBV: неопределенный уровень виремии HBV - <10³ копий/ мл; постоянно низкий уровень виремии HBV - <10³-10⁴ копий/мл; волнообразный уровень виремии HBV - <10³ - 10¹⁰ копий/мл; постоянно высокий уровень виремии HBV - >10⁵ копий/мл.

Обработка результатов проводилась с помощью методов непараметрической статистики с использова­нием критерия Манна-Уитни и критерия ² для сравнения средних величин при отсутствии нормального распределения данных (уровень значимости был принят равным ≤ 0,05). Были определены: процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m). Корреляционный анализ проводился с использованием коэффициента Спирмена. Для определения индивидуального риска развития ЦП использовали модифицированный алгоритм Байеса [^{Witten and E. Frank, "Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques", 2nd Ed., Elsevier, 2005}]. Общий принцип метода выражается формулой:

_,

где P(A) — априорная вероятность гипотезы A ; P(A|B) — вероятность гипотезы A при наступлении события B (апостериорная вероятность); P(B | A) — вероятность наступления события B при истинности гипотезы A; P(B) — вероятность наступления события B.

Для расчета вероятности развития ЦП (далее - ВРЦ) были использованы ранее рассчитанные значения априорной и условной вероятности:



Значения условной вероятности цирроза _ и не цирроза _ рассчитывались как произведения от условных вероятностей всех независимых полиморфизмов: P_ и P_.

Установленные пороговые значения «cut off» составили 0,5 для Pmin и 0,7 для Pmax. ВРЦ > Pmax (0,7) – пациент относится к группе высокого риска развития ЦП. ВРЦ < Pmin (0,5) - пациент относится к группе низкого риска развития ЦП. Если значение ВРЦ находится между Pmax и Pmin (0,5 <ВРЦ <0,7), то вероятность развития ЦП считается неопределенной.

Математическая и статистическая обработка результатов проводилась при помощи программных пакетов «Microsoft Office 2010», SPSS 17.0 (SPSS Inc.,США), MacChiSquare 1.2.0.0 (Marley W. Watkins, США).