Молекулярно-генетические методы и компьютерные технологии в системе эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями 14. 00. 30 эпидемиология 03. 00. 06 вирусология
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Мониторинг микробиоценозов влагалища в системе эпидемиологического надзора при инфекционно-воспалительных, 633.15kb.
- Мониторинг микробиоценозов влагалища в системе эпидемиологического надзора при инфекционно-воспалительных, 642.63kb.
- Эпидемиологического надзора за малярией, 514.35kb.
- Нормативно-методическая и законодательная база деятельности государственного санитарно-эпидемиологического, 55.14kb.
- Модели эволюции. Генетические алгоритмы, 361.44kb.
- Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным, 3372.01kb.
- Дудина кристина Рубеновна хроническая hвv-инфекция: молекулярно-генетические методы, 574.63kb.
- Приказ Первого заместителя председателя Агентства Республики Казахстан по делам здравоохранения, 601.07kb.
- Доклад Управления Роспотребнадзора по Республике Коми об осуществлении государственного, 688.51kb.
- План основных организационных мероприятий управления федеральной службы по надзору, 3516.32kb.
На правах рукописи
ГАРАНИНА Светлана Борисовна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И КОМПЬЮТЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА
ЗА ХАНТАВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ
14.00.30 – эпидемиология
03.00.06 - вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Научные консультанты:
Доктор биологических наук Платонов Александр Евгеньевич
Член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Ющенко Галина Васильевна
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор Самойлова Любовь Владимировна
Член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Урываев Леонид Викторович
Ведущая организация: Государственное учреждение Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.
Защита диссертации состоится «_____» _______________ 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в Государственном учреждении научно-исследовательском Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу:123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Автореферат диссертации разослан "______" ________________________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является одним из наиболее распространенных вирусных, природно-очаговых инфекционных заболеваний человека на территории Российской Федерации. Этиологическими агентами ГЛПС являются хантавирусы - представители семейства Bunyaviridae, рода Hantavirus.
Официальная регистрация заболеваемости в стране введена в 1978 году. Начиная с этого времени и по 2007 г. было зарегистрировано более 184 тысяч случаев ГЛПС в 71 из 83 субъектов РФ. В последние годы отмечается высокая эпизоотическая активность природных очагов хантавирусов, при этом постоянно сохраняется потенциальная опасность заражения людей, находящихся на эндемичных территориях. В настоящее время на территории РФ выявлена циркуляция хантавирусов - Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул, Амур, Тула, Топографов и Хабаровск, которые определяют существование эндемичных природных очагов ГЛПС (Р.А. Слонова с соавт. 1996; Е.А. Ткаченко, С.Г. Дроздов 2002; Л.И. Иванов с соавт. 2003). Установлено, что динамика и интенсивность эпидемических проявлений ГЛПС, различная степень тяжести заболеваний и уровень летальности тесно связаны с инфицированием определенными гено-(серо) типами хантавирусов (Е.В. Лещинская с соавт. 1990).
Известно, что природными резервуарами хантавирусов и источниками заражения людей являются мышевидные грызуны. В отличие от других вирусов семейства Bunyaviridae хантавирусы не передаются членистоногими, инфицирование людей происходит преимущественно при контакте с выделениями зараженных грызунов (Е.А. Ткаченко с соавт. 2001).
Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи возникновения непрогнозируемых вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми хантавирусами, свидетельствуют о несовершенстве действующей системы эпидемиологического надзора.
Слежение за эпизоотическим процессом является одним из основных компонентов эпиднадзора за ГЛПС. Своевременное выявление важных критериев напряжённости эпизоотического процесса, таких как численность грызунов, индексы доминирования основных носителей, уровень их инфицированности и т.д., нацелено на своевременное прогнозирование осложнения эпидситуации. Однако традиционно используемые методы в эпизоотологических исследованиях не позволяют оценить спектр циркулирующих вирусов, определить перечень их основных носителей, что снижает эффективность противоэпидемических мероприятий в целом. Знания об особенностях природных очагов, приуроченных к различным ландшафтно-географическим зонам, позволяют своевременно выявлять предвестники эпизоотической активности очагов и правильно определять тактику профилактических мероприятий (А.Д. Бернштейн с соавт. 2004).
Преимущества молекулярно-генетических методов в отношении диагностики (детекции, идентификации) хантавирусов приобретают особую значимость в связи с существующими трудностями при размножении этих вирусов в клеточных культурах и отсутствием удачной лабораторной модели инфекции. ПЦР является практически единственным методом, позволяющим дать прямое доказательство наличия хантавирусов в различных биологических материалах, полученных как от человека, так и от животных (А.Е. Деконенко, Е.А. Ткаченко 2004). Беспрецедентным в вирусологии является выделение 9-ти самостоятельных видов хантавирусов (Bayou, Laguna Negra, Isla Vista, Rio Mamore и др.), циркулирующих на Американском континенте, только на основании данных о нуклеотидных сиквенсах их геномов, без изоляции вирусной культуры (A. Plyusnin 2002).
Эпидемический процесс при ГЛПС чрезвычайно сложен и зависит от большого числа факторов – социально-экономических, экологических, природно-климатических, которые не всегда поддаются быстрому и объективному анализу. Оценивая пути оптимизации эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями, следует признать важность практического внедрения информационно-аналитических технологий, позволяющих достоверно оценивать связь значимых эпидемиологических параметров с ландшафтно-географическими характеристиками изучаемых территорий. Использование в целях эпидемиологического надзора за природно-очаговыми инфекциями ГИС-технологии позволяет проводить ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ в режиме реального времени (Б.Л. Черкасский с соавт. 2005), оценивать эпидемическую активность природных очагов, и определять риск инфицирования людей (R.J. Eisen с соавт. 2007; C. Linard с соавт. 2007).
Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.
Цель работы – разработка и адаптация молекулярно-генетических методов и современных компьютерных технологий для усовершенствования научно-теоретических и практических основ эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями.
Основные задачи исследования.
- Провести анализ эпидемических проявлений ГЛПС на территории РФ
и обосновать необходимость оптимизации эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями.
- Усовершенствовать схемы лабораторно-диагностических и эпизоотологических исследований в системе эпиднадзора за ГЛПС на основе молекулярно-генетических методов.
- Разработать и адаптировать молекулярно-генетические методы для индикации и дифференциации вирусов комплекса ГЛПС. Оценить возможности молекулярных технологий (ПЦР-анализа, секвенирования РНК-изолятов) при изучении заболеваемости в очагах ГЛПС.
- Провести генотипирование и филогенетический анализ новых хантавирусов, выявить молекулярные маркёры для дифференциации штаммов на уровне подвида. Оценить гетерогенность популяций хантавирусов, формирующих природные очаги инфекции на Европейской части Российской Федерации.
- Определить структуру и сформировать информационную базу данных в электронном формате для картографического анализа эпидемиологически значимых параметров с помощью технологии географической информационной системы.
- Провести оценку эпидемического потенциала территории и определить степень риска заражения людей ГЛПС с использованием информации о молекулярно-эпидемиологических особенностях циркуляции хантавирусов на основе ГИС-технологии (на модели Липецкой области).
- Обосновать роль и значение современных методических подходов и технологий для оптимизации эпидемиологического надзора за ГЛПС.
Научная новизна и теоретическая значимость.
Сформированы основные положения молекулярно-эпидемиологического мониторинга, необходимые для оптимизации эпидемиологического надзора за ГЛПС на современном этапе.
Использование разработанных молекулярно-генетических методик (на основе ПЦР-анализа и секвенирования фрагментов генома) позволило впервые изучить генетическое разнообразие популяций вирусов комплекса ГЛПС и оценить эпидемиологический потенциал природно-очаговых территорий с учётом спектра циркулирующих хантавирусов. Впервые картографический анализ эпидемиологически значимых критериев, выполненный на основе ГИС-технологии с применением математических и статистических методов, позволил объективно провести эпидемиологическое районирование модельной территории по уровню опасности инфицирования ГЛПС.
Показаны возможности использования ПЦР-анализа для решения ряда эпидемиологических задач, связанных с изучением заболеваемости ГЛПС, верификацией клинического диагноза, выявлением основных источников инфекции и определением границ природных очагов хантавирусов. Некоторые теоретические и практические вопросы вирусологии, касающиеся идентификации хантавирусов, определения их таксономической принадлежности, характеристики гетерогенности вирусных популяций, были решены с помощью разработанных молекулярно-генетических методик – ПЦР-анализа и секвенирования выбранных фрагментов генома.
Впервые были сконструированы системы универсальных консенсусных праймеров на основе фрагментов кодирующей части генома хантавирусов – гена нуклеопротеина N (S-сегмента) и гена гликопротеина G2 (М-сегмента); на их основе разработаны ПЦР-методики для выявления широкого спектра штаммов хантавирусов комплекса ГЛПС (Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул, Тула), циркулирующих в природе.
Разработаны принципы генотипирования хантавирусов на основе секвенирования изолятов РНК, выявленных в ПЦР с помощью предложенных универсальных праймеров. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена пригодность выбранных фрагментов генома для их последующего филогенетического анализа.
В пределах, используемых для филогенетического анализа фрагментов аминокислотных последовательностей, обнаружены молекулярные маркёры, позволяющие различать штаммы хантавирусов комплекса ГЛПС из различных регионов РФ.
При проведении молекулярно-генетических исследований полевого и клинического материала, полученного из 9 регионов РФ, установлена высокая эффективность разработанных методик для лабораторной диагностики ГЛПС, в том числе при исследовании природных очагов - для выявления, идентификации и характеристики новых геновариантов хантавирусов. Получены новые данные о генетическом разнообразии и географической распространённости хантавирусов, формирующих природные очаги ГЛПС на территории Российской Федерации. Впервые с помощью молекулярных технологий выявлена циркуляция новых геновариантов вируса Добрава на территории Астраханской области и Республики Калмыкии, ранее считавшейся неэнзоотичной по ГЛПС.
Технологические возможности разработанных методик были продемонстрированы во время изучения вспышечной заболеваемости в Центральном Черноземье - для этиологической расшифровки и установления родства РНК-изолятов вируса Добрава, выявленных от больных ГЛПС и полевых мышей (A.agrarius), основных источников инфекции.
Впервые с использованием количественных вариантов ПЦР в режиме реального времени были получены данные по динамике вирусной нагрузки у больных ГЛПС, инфицированных вирусом Пуумала. Это позволило определить оптимальные сроки, в которые применение ПЦР-анализа для диагностики ГЛПС наиболее целесообразно.
Практическая значимость работы.
Предложена схема усовершенствования эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями, предусматривающая использование молекулярно-генетических методов и ГИС-технологии. Разработанные методические подходы могут быть использованы в практике работы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) с целью оптимизации прогнозирования и профилактики заболеваемости ГЛПС.
Показано, что включение молекулярно-генетического компонента в систему эпиднадзора обеспечивает: возможность верификации диагноза в ранние сроки заболевания, быструю дифференциацию возбудителя до вида и оценку уровня отличий новых вирусных РНК-изолятов от выявленных ранее штаммов хантавирусов, идентификацию места (области, региона), где произошло инфицирование человека ГЛПС, а также возможность более точной оценки эпидемического потенциала природных очагов хантавирусов.
Сконструированы диагностические тест-системы на основе ПЦР, позволяющие осуществлять прямую детекцию и дифференциацию хантавирусов в полевом и клиническом материале, а также оценивать количество вирусных частиц в исследуемых пробах.
Для анализа эпидемических проявлений хантавирусных инфекций на территории Липецкой области была сформирована электронная база данных в формате, совместимом с программой ГИС «КОМПАС» (разработанной в ГУ Институте проблем передачи информации РАН, Москва). База данных «ГЛПС в Липецкой области», включающая эпидемиологически значимую информацию, необходимую для определения эпидемического потенциала исследованных территорий и оценки риска заражения людей, используется на практике в работе региональных Управлений Роспотребнадзора.
Внедрение полученных результатов.
• ПЦР-тест-система «АмплиСенс Хантавир» для детекции хантавирусов Пуумала, Добрава, Тула, Сеул, Хантаан разработана и передана вместе с необходимой нормативно-технической документацией на производство ЦНИИ эпидемиологии.
• Депонированы в Международный компьютерный банк данных GenBank 226 фрагментов нуклеотидных последовательностей М- и S- сегментов геномов хантавирусов Добрава, Пуумала и Тула, выявленных на территории Российской Федерации в 2003-2008 гг. Нуклеотидные последовательности зарегистрированы в базе данных GenBank под следующими номерами - DQ064647-064689; DQ061255-DQ061272, EU549802-549815, EU562892-563018, EU652420 - EU652443.
• Разработанный алгоритм программы ГИС «КОМПАС» для картографического анализа эпидемиологически значимых критериев вместе с приложением - электронной базой данных «ГЛПС в Липецкой области» используется в работе ФГУЗ Роспотребнадзора «Центр гигиены и эпидемиологии в Липецкой области».
• Методические указания «Организация молекулярно-генетических исследований биологического материала из природных очагов ГЛПС» утверждены Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ.
Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре эпидемиологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены:
- на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002);
- на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004);
- на научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005);
- на Международной конференции по инфекционным болезням (ICEID) (Атланта, США, 2006 г.);
- на Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» (Алматы, 2006);
- на научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006);
- на Всероссийском научно-практическом съезде общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007);
- на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, 2007);
- на Всероссийской научно-практической конференции «Организация противоэпидемических мероприятий по профилактике геморрагической лихорадке с почечным синдромом» (Оренбург, 2007);
- на межрегиональной научно-практической конференции «Состояние здоровья населения центрального федерального округа» (Липецк, 2007);
- на Международной конференции по зоонозным инфекциям - «Emerging Zoonoses», (Лимассол, Кипр, 2007);
- на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007).
Апробация диссертационной работы состоялась на Учёном совете ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора 15 октября 2008 года.
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 36 опубликованных научных работах, в том числе 9 статей опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, выводов, списка использованной литературы, включающего 277 зарубежных и 55 отечественных источников. Общий объем работы составляет 239 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 27 таблицами и 51 рисунком.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалы. Для анализа эпидемических проявлений ГЛПС на территории России использовалась государственная статистическая отчётность Роспотребнадзора.
Для выполнения поставленных в ходе настоящей работы задач использовался полевой и клинический материал, исследование которого проводилось с помощью молекулярно-генетических и иммуносерологических методов (табл. 1). Методом ПЦР было исследовано 1728 проб (848 – от людей и 880 от грызунов), из которых 272 пробы были секвенированы. В ходе работы были использованы результаты иммунологических исследований 6435 образцов (5879 проб от мелких млекопитающих исследованы в ИФА; 482 пробы от людей и 74 от грызунов – в НМФА), из них 301 проба была серотипирована.
Исследование биологического материала иммуносерологическими методами проводили на базе федеральных государственных учреждений здравоохранения «Центров гигиены и эпидемиологии» РФ. Серотипирование сывороток крови от больных людей и проб от грызунов осуществлялось сотрудниками ФГУП ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН на базе лаборатории геморрагических лихорадок.
Таблица 1.
Биологический материал, исследованный с помощью молекулярно-генетических и иммуносерологических методов
| Регион исследования (период) | Вид материала | Лабораторные методы исследования | ||||
| ПЦР | ИФА | НМФА | Секвениро- вание | Серотипи- рование | ||
| Астраханская область, (2004-2005) | Суспензии органов ММ* | 389 | 74 | 74 (МФА) | 18 | 4 |
| Кровь от больных с различными диагнозами и доноров | 200 | н.и.** | н.и. | н.и. | н.и. | |
| Республика Башкортостан (2005) | Кровь от больных ГЛПС | 50*** | н.и. | 5 | 5 | н.и. |
| Самарская область (2003) | Суспензии органов ММ | 190 | 190 | н.и. | 10 | н.и. |
| Липецкая область (2002-2008) | Суспензии органов ММ | 163 | 5477 | н.и. | 61 | 32 |
| Кровь от больных с диагнозом ГЛПС | 15 | н.и. | 335 | 9 | 265 | |
| Воронежская область (2006-2007) | Суспензии органов ММ | 40 | 40 | н.и. | 38 | н.и |
| Кровь от больных с диагнозом ГЛПС | 21 | н.и | 21 | 3 | н.и | |
| Оренбургская область (2006-2007) | Суспензии органов ММ | 33 | 33 | н.и. | 11 | н.и. |
| Кровь от больных с диагнозом ГЛПС | 42 | н.и. | 42 | 13 | н.и. | |
| Курская область (2007-2008) | Суспензии органов ММ | 26 | 26 | н.и. | 15 | н.и. |
| Кровь от больных с диагнозом ГЛПС | 2 | н.и | 2 | 2 | н.и | |
| Тамбовская область (2007) | Суспензии органов ММ | 11 | 11 | н.и. | 6 | н.и. |
| Тюменская область (2006) | Суспензии органов ММ | 18 | 18 | н.и. | 18 | н.и. |
| Омская область (2005) | Суспензии органов ММ | 10 | 10 | н.и. | 10 | н.и. |
| Удмуртская Республика (2003-2005) | Кровь от больных с диагнозом ГЛПС | 30 | н.и. | 30 | 6 | н.и. |
| Кровь от больных ГЛПС | 470*** | н.и. | 47 | 47 | н.и. | |
| Итого за 2002-2008 гг. | Образцов крови от людей | 848 | - | 482 | 85 | 265 |
| Образцов суспензий органов ММ | 880 | 5879 | 74 | 187 | 36 | |
н.и.** - не исследовали
*** - образцы крови от больных ГЛПС взяты в динамике (10-кратно от каждого пациента)