Методические указания к лабораторным и практическим занятиям студентам аграрного института

Вид материала

Методические указания

Содержание 7.3.1. Учет на плотных средах Учет микроорганизмов на МПА. Учет микроорганизмов на КАА Учет на среде Эшби. Учет грибов на агаровых средах. 7.3.2. Учет на жидких средах Экспресс-обработка результатов учета микроорганизмов методом предельных разведений

Подобный материал:

• Методические указания к лабораторным занятиям (Стоматология), 640.88kb.
• Методические указания к изучению курса и практическим занятиям для студентов спец., 914.85kb.
• Методические указания к лабораторным занятиям для студентов Vкурса специальности «Агрономия», 1655.23kb.
• Методические указания по лабораторным занятиям По дисциплине Базы данных Для специальности, 364.77kb.
• Методические указания для доаудиторной подготовки к практическим занятиям по эпидемиологии, 1893.8kb.
• Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов очного и заочного, 620.25kb.
• Методические указания к практическим занятиям и индивидуальные домашние задачи по физике, 635.57kb.
• Методические указания по практическим занятиям По дисциплине Математические методы, 129.27kb.
• Методические указания Задания к практическим занятиям Контрольные задания, 752.95kb.
• Методические указания по лабораторным занятиям По дисциплине, 531.16kb.

7.3. Определение численности различных групп микроорганизмов


7.3.1. Учет на плотных средах

После инкубации засеянные среды вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний.

Одновременно после сушки бюксов с навесками при 105°С до постоянной массы определяют содержание абсолют­но сухой почвы в 1 г анализируемой сырой почвы (см. 5.1.1).

При подсчете колоний на богатых плотных питатель­ных средах (МПА, МПА + сусло-агар, КАА, сусло-агар, среда Чапека, среда Эшби и т. д.) закрытые чашки Петри просмат­ривают в проходящем свете и с внешней стороны колонии отмечают чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкие колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Желательно использовать специальный прибор с арифмометром.

Число колоний на бедных средах (нитритный агар, «голодный» агар, агаризованный почвенный экстракт и т. д.) определяют под микроскопом окуляр 10х и объектив 3х, в крайнем случае — окуляр 10х и объектив 8х.

В чашках Петри сначала учитывают колонии в 100 полях зрения, затем определяют среднее арифметическое для одного поля зрения. Для определения числа колоний на всей чашке среднее число колоний в одном поле зрения умножают на ко­эффициент (К), который равен площади чашки Петри (Р), де­ленной на площадь поля зрения (р):

К=

Диаметр чашки Петри измеряют линейкой, а диаметр поля зрения — под микроскопом, используя для малых увели­чений миллиметровую бумагу, а для больших (объективы 40х и 90х) — объективный микрометр.

Подсчитав при поверхностном посеве число колоний на чашке, находят содержание клеток в 1 мл соответствующего разведения, умножая число колоний на 20, так, как посеяно, было 0,05 мл суспензии. Чтобы определить количество клеток в 1 г сырой почвы, их содержание в 1 мл умножают на степень разведения (10³, 10⁴, 10⁵ и т. д.).

Для учета микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы число клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолют­но сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета. Установлено, что при поверхностном посеве почвенной суспензии из разведения 10^-3 число колоний на чашке равно 52; влажность почвы — 25%; при такой влажности 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы. Число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы (х) определяют следующим образом:

Х= 52201000 = 1 386 666 (клеток)

0,75

При глубинном посеве число колоний в 1 г абсолютно сухой почвы подсчитывают так же, но не умножают на 20, так как при вы­севе используют 1 мл суспензии, а не 0,05 мл.

Учет микроорганизмов на МПА. Проводят его визуально на 4-й день после посева. При наличии колоний В. Mycoides количество микроорганизмов определяют на 2-й или 3-й день. После подсчета всех колоний на чашке их группируют по культуральным признакам и определяют роды (а иногда и виды) микроорганизмов.

Учет микроорганизмов на КАА. Колонии на таком агаре подсчитывают на 7-10-й день. Из общего количества микрорганизмов отдельно учитывают: пигментированные формы желтые и другие микобактерии, образующие мелкие купол образные колонии, актиномицеты (Streptomyces).

Отмечают окраску колоний, воздушного мицелия (серая, белая, зеленовато-серая, розовая) и среды (выделение пигмента в субстрат). Для описания пигментации можно использовать специальные пособия по определению цвета.

При идентификации актиномицетов описывают консистенцию колоний (плотные, кожистые, рыхлые), поверхность (мучнистая, бархатистая) и запах (землистый, эфирный, фрук­товый).

Учет на среде Эшби. Проводят на 5-6-е сутки. Отдельно подсчитывают колонии азотобактера — плоские, слизистые, мажущейся консистенции, диаметром 5-10 мм.

Учет грибов на агаровых средах. Колонии грибов на сусло-агаре или среде Чапека подсчитывают через 2 суток инкуба­ции. После 7 суток определяют родовой состав.

В почве часто встречаются грибы родов: Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Macrosporium и др.


7.3.2. Учет на жидких средах

При определении численности микроорганизмов на жидких средах отмечают крестом пробирки с разведением, в которых развились представители исследуемой группы. Затем для более точного подсчета используют таблицу Мак-Креди, составлен­ную на основании обработки многочисленных результатов методом вариационной статистики. В соответствии с требования­ми, предъявляемыми к расчетам, необходимо составить число­вую характеристику из трех цифр (табл. 1).

Первая цифра соответствует числу параллельно засеянных пробирок данного разведения (отмечается последнее раз ведение, в котором рост микроорганизмов наблюдается во всех параллельных пробирках). Следующие две цифры обозначают число пробирок, в которых обнаружен рост микроорганизмов в последующих двух разведениях. В таблице Мак-Креди находят вероятное число клеток, соответствующе числовой характеристике, и эту цифру умножают на степень разведения, при которой отмечен рост во всех параллельных пробирках.


Пример расчета

Разведение 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6

Число параллельно засеянных

про­бирок 4 4 4 4 4

Число пробирок, в которых

обнаружен рост 4 4 2 1 0

Числовая характеристика — 421; вероятное число клеток — 9,5 (найдено в таблице). Для учета клеток в 1 г абсолютно сухой почвы полученное число клеток умножают на 1000 (поскольку первая цифра числовой характеристики определяет соответствующее разведение: 10^-3 или 0,001) и делят на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы (учитывая ее влажность). При влажности почвы 25% абсолютно сухой почвы в 1 г сырой почти будет 0,75 г. Найденное число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы составит:

9,5 • 1000 ₌

0,75 12 666 (клеток).


Таблица 1