Цитофизиологические особенности крови промысловых рыб Волго-Каспийского канала

Вид материала

Автореферат

Содержание Козак Маргарита Федоровна Фельдман Бронислав Владимирович Общая характеристика работы Цель работы Задачи исследования Научная новизна и теоретическая значимость работы Практическая значимость работы. Апробация работы. Основные положения, выносимые на защиту Структура и объем работы Декларация личного участия автора. Обзор литературы Условные сокращения и обозначения РЕЗУЛьтаты исследованиЙ и их обсуждение Анализ физиологического состояния рыб в зависимости от состояния гематологических показателей и инвазированности паразитами Общее среднее В летний период 3.3. Анализ физиологического состояния организма леща европейского Анализ состояния периферической крови исследованных особей леща Общее среднее ... Полное содержание

Подобный материал:

• Рыбохозяйственные и экологические аспекты эффективности искусственного воспроизводства, 422.61kb.
• Комментарий начальника Регионального управления фскн россии А. Долбни о целях проведения, 12.87kb.
• Характеристики отрядов, подотрядов и семейств рыб, их многообразие в зависимости, 587.95kb.
• Итоги и перспективы изучения паразитов и болезней морских промысловых гидробионтов, 211.89kb.
• Урок по теме: «Костные рыбы», 73.15kb.
• Лекция №15. Тема: Товароведная характеристика и таможенная экспертиза промысловых рыб, 130.05kb.
• Урок по теме: многообразие рыб. Класс костные рыбы. Цель, 59.64kb.
• Рабочая учебная программа по дисциплине Гематология Для специальности, 174.73kb.
• План лекций для студентов педиатрического факультета на весенний семестр 2011-2012, 50.89kb.
• Основные группы рыб, их роль в природе и практическое значение, 29.02kb.

На правах рукописи


Кузина Татьяна Вячеславовна


цитофизиологические особенности крови промысловых рыб Волго-Каспийского канала


Специальность 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология


АВТОРЕФЕРАТ


диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Астрахань, 2011

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, генетики и биохимии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет».

Научный руководитель	Козак Маргарита Федоровна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:	Ильинских Николай Николаевич, чл. корр. АН ВШ РФ, доктор биологических наук, профессор, Томск.
	Фельдман Бронислав Владимирович доктор биологических наук, доцент, Астрахань
Ведущая организация:	Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова

Защита состоится «27» мая 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д.1. ауд. 101.

Тел./ факс (8512) 51-82-64

E-mail: sovetei@rambler.ru


Текст автореферата диссертации размещен на официальном сайте Астраханского государственного университета: nofollow" href=" " onclick="return false">ссылка скрыта


Отзыв на автореферат (2 экземпляра, заверенные печатью) просим направлять по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д. 1, АГУ, ученому секретарю диссертационного совета ДМ 212.009.01.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета.


Автореферат разослан «26» апреля 2011г.


Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Ю.В. Нестеров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальной проблемой современной физиологии и клеточной биологии в плане определения критериев для раннего прогнозирования изменения структуры популяций животных и растений является разработка экспериментальных моделей, методов цитологической диагностики нормального или патологического состояния, начала патологического процесса. Любой патологический процесс, какой бы степенью функциональных нарушений он не проявился, начинается на уровне структуры и ультраструктуры клетки. Начальные стадии патологического процесса, как правило, обратимы и могут быть компенсированы.

Многообразие функций крови ставит ее в ряд ценных индикаторов состояния отдельной особи и популяции особей данного вида. Функциональные и структурные изменения форменных элементов крови под действием различных экзогенных и эндогенных факторов могут быть причиной нарушения кроветворения на разных этапах онтогенеза рыб, однако исследования в этой области немногочисленны. Научный и практический интерес представляет не только изучение различных морфологических и физиологических нарушений, происходящих при гемопоэзе, в частности при эритропоэзе. Весьма актуально исследование взаимосвязи патологии этих процессов с воздействием различных внешних и внутренних факторов. Различные реакции крови на изменение функционального состояния особи в ответ на экзогенные и эндогенные воздействия являются неспецифичными и могут быть использованы как средство ранней диагностики нормального или патологического состояния. Анализ гематологических показателей является одним из важнейших аспектов оценки физиологического статуса организма, его гомеостаза. Изучение морфологических нарушений элементов крови, оценка цитофизиологических особенностей и изменений является необходимым элементом наблюдения за состоянием популяций рыб, как в рыбоводной практике, так и при прогнозировании динамики популяций в естественных условиях. Решение указанной проблемы позволит использовать ряд интегративных показателей для оценки физиологического состояния организма для ранней диагностики развития патологии промысловых рыб.

Цель работы: Анализ цитофизиологических особенностей периферической крови, динамики патологических изменений форменных элементов крови в условиях повышенной антропогенной нагрузки Волго-Каспийского канала для диагностики изменений, связанных с хроническим токсикозом особей промысловых видов рыб.

Задачи исследования:

1. Определить состояние гематологических показателей и их изменение по годам и сезонам года для характеристики физиологического состояния организма промысловых рыб (судак и лещ) в зависимости от действия эндогенных и экзогенных факторов.
   
2. Провести анализ цитофизиологических особенностей и типов патологических изменений форменных элементов крови рыб Волго-Каспийского канала.
   
3. Оценить характер и частоту возникновения микроядер в эритроцитах периферической крови, как одного из признаков проявления хронического токсикоза рыб Волго-Каспийского канала.
   
4. Выявить корреляционные взаимосвязи частоты возникновения микроядер в эритроцитах крови с гидрохимической и токсикологической характеристиками воды Волго-Каспийского канала.
   

Научная новизна и теоретическая значимость работы

• Впервые в течение ряда лет (2006-2008 гг.) по сезонам года проведены систематические исследования изменений основных параметров крови промысловых рыб (судак и лещ) Волго-Каспийского канала с анализом факторов на них влияющих.
  
• В динамике лет и сезонов проведён анализ цитофизиологических особенностей и типов патологических изменений форменных элементов крови промысловых рыб.
  
• Для ранней диагностики развития патологического процесса в условиях повышенной антропогенной нагрузки Волго-Каспийского канала применен комплексный подход, включающий методы гематологического и цитогенетического анализа.
  
• Дана оценка характера и частоты возникновения микроядер в эритроцитах периферической крови, как одного из признаков проявления хронического токсикоза рыб Волго-Каспийского канала.
  
• Выявлены корреляционные взаимосвязи частоты возникновения микроядер в эритроцитах крови с гидрохимической и токсикологической характеристиками воды Волго-Каспийского канала.
  

Практическая значимость работы.

Установлено, что показатель «частота встречаемости микроядер в эритроцитах периферической крови рыб» может быть использован в качестве объективного критерия для дифференциальной диагностики результатов нормального процесса гемопоэза или патологического его течения.

Микроядерный тест может быть использован в качестве объективного индикатора для экспресс-оценки состояния популяций рыб, оценки стабильности их генетического аппарата, а также для оценки состояния среды обитания, прогнозирования влияния на популяционно-генетическую структуру рыб негативных факторов среды. Данные, полученные в ходе изучения морфологических изменений элементов крови, оценки цитофизиологических особенностей и изменений клеток крови могут применяться для наблюдения за состоянием популяций рыб, как в рыбоводной практике, так и при прогнозировании динамики популяций в естественных условиях.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на научных конференциях: Межвузовской конференции молодых ученых РГПУ «Герценовские чтения» (Санкт-Петербург, 2005; 2006); XIII Международной молодежной школы-конференции (Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина, Рыбинск, 2007); на X Международной научно-практической конференции, посвященной 450-летию Астрахани (Астрахань, 2008); Международной научно-практической конференции «Комплексный подход к проблеме сохранения и восстановления биоресурсов Каспийского бассейна» (Астрахань, 2008); Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования университетов, интеграция в региональный инновационный комплекс»: доклады молодых ученых в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», (Астрахань, 2010); Международной конференции «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).

Публикации. Результаты исследования изложены в 15 статьях, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В периферической крови рыб Волго-Каспийского канала установлена динамика гематологических показателей в зависимости от сезона года, стадии зрелости гонад, семенников и пола особей.
   
2. Разнообразие патологических изменений клеток периферической крови рыб, их общий высокий уровень указывают на наличие постоянного стрессорного воздействия комплекса внешних и внутренних факторов на организм.
   
3. Частота возникновения микроядер в эритроцитах крови рыб превышает уровень, наблюдаемый при спонтанном мутагенезе.
   
4. Уровень (частота возникновения) клеток с микроядрами имеет устойчивые взаимосвязи с другими гематологическими показателями, характеризующими физиологическое состояние рыб, а также с токсикологическими и гидрохимическими показателями, характеризующими среду их обитания.
   

Структура и объем работы. Диссертация содержит 181 страницу печатного текста, 26 таблиц, 29 рисунков, включает введение, четыре главы, заключение, выводы, список литературы. Список литературы содержит 296 источников, из них 258 отечественных и 38 иностранных.

Декларация личного участия автора. Исследования на тоневом участке Волго-Каспийского канала, анализ и обобщение результатов, представленных в диссертации, проведены лично соискателем.

Благодарности. Считаю своим долгом выразить искреннюю признательность заведующей и сотрудникам лаборатории ихтиопатологии ФГУП «КаспНИРХ» за помощь в сборе и обработке материалов исследования; руководителю экологического направления исследований ФГУП «КаспНИРХ» к.г.н. Д.Н. Катунину.

Особую признательность автор выражает научному руководителю, доктору биологических наук, профессору Козак М.Ф. за помощь, ценные советы и рекомендации.


Глава 1. Обзор литературы

В работе представлен обзор работ отечественных и зарубежных авторов, включающих данные о клеточных элементах нормального гемопоэза рыб (Иванова Н.Т., 1983, 1995, 2002; Федорова Н.Н., Грушко М.П., 2008, 2009, 2010; Головина Н.А., 1989, 2003 и другие), классификацию форменных элементов крови исследуемых видов рыб Волго-Каспийского бассейна (Иванова Н.А., 1983, 2002), данные о патологических изменениях морфологии клеток крови рыб (Житенева Л.Д., 1989, 2004 и др.; Микряков В.Р., 1990; Журавлева Г.Ф. и другие, 1990; Моисеенко Т.И., 1998; Рудницкая О.А. и другие, 2000; Федорова Н.Н., Ложниченко О.В., 2005, 2008).

Кумулятивный токсикоз (Журавлева Г.Ф., Земков Г.В., 1987, 2003, 2004; Чеботарева Ю.В., 1996; Алтуфьев Ю.В., 1990, 1999; Моисеенко Т.И., 2005) рассматривается как следствие накопления в организме рыб стабильных химических токсикантов и причина патологических изменений физиологического состояния. Явление микроядерности в эритроцитах рыб и других объектов рассматривается, как признак развития патологических процессов в периферической крови. Дается анализ причин образования микроядер (Бродский В.Я., Урываева И.В., 1987; Ильинских Н.Н., 1989; 1992; Жулева Л.Ю., Дубинин Н.П., 1994; Чеботарева Ю.В., 1996; Аббасова А.Р., Палатников Г.М., 2004; Ильин Д.А., 2009 и другие). Приводится гидрохимическая и токсикологическая характеристика воды Волго-Каспийского канала (Ежегодник Астраханского ЦГМС, 2007, 2008, 2009, 2010).


Глава 2. Объекты, материал и методы исследования

Объекты исследования - клеточные элементы гемопоэза половозрелых особей мужского и женского пола: судака обыкновенного (Stizostedion lucioperca) и леща европейского (Abramis brama).

Таблица 2.1.

Объем материала для исследования

Сезон исследования	Промысловая длина, см		Масса, г		Пол		Возраст			Количество клеток для анализа
	Интервал варьирования (min ÷ max)	M±m	Интервал варьирования (min ÷ max)	M±m	Самцы, шт.	Самки, шт.	Неполовозрел лые особи	2-3 года	3-4 года
Судак обыкновенный
Осень	31,0-59,0	41,9±0,9	570-2200	1106,8±80,4	19	56	2	73		75000
Лето	36,0-50,0	40,5±0,8	550-1670	891,0±57,0	13	37	2	48		51741
Итого					32	93	4	121		126741
Лещ европейский
Осень	23,0-32,0	28,0±0,5	260,0-680,0	468,8±21,9	32	43	2		73	75000
Весна	23,0-35,0	27,0±0,6	250,0-670,0	409,3±20,1	23	27	3		47	50000
Итого					55	70	5		120	125000
Всего					250 особей					251741

Вылов рыб для анализа производился весной и осенью с 2006 по 2008 гг. на тоневом участке Волго-Каспийского канала. Исследуемые особи не имели видимых повреждений и внешних проявлений каких-либо заболеваний.

Методы отбора и обработки проб при гематологическом исследовании

Гематологический анализ периферической крови проводили, используя общепринятые апробированные методики, согласно «Методическим указаниям по проведению гематологического обследования рыб» (Методические указания, № 13-4-2 / 1487 от 02.02.1999г.). Периферическую кровь отбирали из хвостовой артерии методом отсечения хвоста в момент вылова рыб. Цельную кровь собирали в пробирки, предварительно обработанные раствором антикоагулянтов, не менее 5 мл. Для каждой особи готовили не менее двух мазков, согласно методике («Изготовление, фиксация и окраска мазков (тотальные препараты)», Ромейс Б., 1953; Роскин Г.И., Левинсон Л.Б., 1957). Препараты высушивали на воздухе, фиксировали 96⁰ этанолом.

Гематологические показатели: концентрация гемоглобина, г/л; скорость оседания эритроцитов, мм; содержание гемоглобина в одном эритроците, пг; число лейкоцитов ×10⁹ в л.; количество эритроцитов ×10¹² в л.; лейкоцитарная формула (процентное соотношение лейкоцитов на мазках периферической крови), определялись согласно «Методическим указаниям по проведению гематологического обследования рыб» (1999). Количество гемоглобина в крови рыб определяли гемоглобинцианидным (HbCN) методом с помощью диагностических наборов Гемоглобин-АГАТ, на гемоглобинометре Микролаб-540, Юнимед, ФБС-01-2. СОЭ определялась в аппаратах Панченкова. Подсчет количества эритроцитов проводился с помощью камеры Горяева. Для выражения степени насыщенности эритроцитов гемоглобином вычисляли содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЭ) в пг (Иванова Н.Т., 1983). Для определения соотношения лейкоцитов мазки периферической крови окрашивали азур-эозином по Романовскому (Диахим-ГемиСтейн-Р) (1 капля основного раствора на 1 см³ дистиллированной воды с рH 6,8-7,0).

Лейкоцитарная формула крови определялась на окрашенных препаратах при использовании светового микроскопа (Olympus) при увеличении 10×100. На мазках подсчитывали 200 лейкоцитов по общепринятой методике (Методические указания…, 1999). Общее число лейкоцитов учитывали косвенным методом. Определяли число лейкоцитов, встречающихся при подсчете на 1000 эритроцитов в мазке крови и пересчитывали их количество на 1 мкл по формуле: Х=(A*B)/1000, где Х-общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови, A-число эритроцитов в 1 мкл крови, определенное в камере Горяева, B-число лейкоцитов, определенное при подсчете 1000 эритроцитов на мазке крови. Патологические изменения форменных элементов крови рыб определяли согласно рекомендациям Л. Д. Житеневой с соавторами (1989). В процессе исследования учитывалась инвазированность рыб паразитами. Определение паразитов проведено совместно с научными сотрудниками лаборатории ихтиопатологии ФГУП «КаспНИРХ».

Методы отбора и обработки проб при исследовании микроядер в клетках периферической крови рыб

Исследование микроядер в клетках крови рыб выполнено микроскопическим методом на репрезентативных выборках тестовых объектов и клеток: эритроциты периферической крови судака (S. lucioperca) и леща (A. brama). Мазки периферической крови готовили согласно методике «Изготовление, фиксация и окраска мазков (тотальные препараты)» Ромейс Б. (1953), Г. И. Роскин, Л. Б. Левинсон (1957), в момент вылова рыб, высушивали на воздухе, фиксировали 96⁰ этанолом. Для выявления микроядер в эритроцитах периферической крови судака (S. lucioperca) и леща (A. brama) мазки окрашивали сначала красителем азур-эозином по Романовскому (1 капля основного раствора на 1 см³ дистиллированной воды с рH 6,8-7,0) в течение 20 мин. Затем окрашивали красителем Giemsa-Solution Microscopy grade (AppliChem, Germany) (2 капли красителя на 1 мл. дистиллированной воды с рH 6,8-7,0) в течение 15 минут. Патоморфологические нарушения структуры ядра определяли согласно рекомендациям Л.Д. Житеневой с соавторами (1989). Анализ препаратов проводили путем микрокопирования окрашенных мазков с помощью микроскопа «Olympus» при увеличении 10×100. На препаратах проводился учет эритроцитов с микроядрами и другими фенотипическими отклонениями от нормальной конфигурации интерфазного ядра. Микроядра определяли, пользуясь следующими критериями, разработанными доктором Дж. Мерч и другими авторами (Mersh J. и др., 1996):

• Микроядра представляют собой сферические цитоплазматические включения хроматина, имеющие четкий контур.
  
• Диаметр МЯ варьирует от одной десятой до одной трети диаметра ядра.
  
• Микроядра «похожи» на ядро по структуре и окраске.
  
• Микроядра не связаны с ядром.
  

Долю клеток с микроядрами (МЯ %) определяли отношением количества клеток с микроядрами к общему количеству проанализированных эритроцитов. Аналогично оценивали долю клеток с другими типами патологии ядра.

Полученные данные подвергались статистической оценке с использованием пакета лицензионных программ Microsoft Office Excel 2003, Statistica 6.0. Установление зависимостей между исследуемыми показателями проведено методом корреляционного анализа с помощью программы Microsoft Office Excel 2003 на основе операционной системы Windows XP Professional. Для оценки достоверности разности средних и выборочных долей между показателями использовался критерий Стьюдента и альтернативный анализ. (Лакин Г.Ф., 1973; Козак М.Ф., 1995; Рокицкий П.Ф., 1973; Glantz S.A., McGraw Hill, 1998; Стентон Г., 1999 и другие).


Условные сокращения и обозначения, принятые в дальнейшем

Hb – гемоглобин, СГЭ – среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Эр – эритроциты, Мн – моноциты, Пбф – псевдобазофилы, Пэф – псевдоэозинофилы, Эф – эозинофилы, Нф – нейтрофилы, Лф – лимфоциты, МЯ – микроядра, М - среднее значение показателя, m – ошибка репрезентативности среднего, n – объем выборки, σ – стандартное отклонение, р – уровень значимости (вероятность ошибки репрезентативности), m_p – ошибка доли, lim: min ÷ max – интервал варьирования: распределение данных по области значений, СЗГ – стадия зрелости гонад, В-К канал - Волго-Каспийский канал.


РЕЗУЛьтаты исследованиЙ и их обсуждение