Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии сельскохозяйственных растений Часть

Вид материала

Подобный материал:

1 2 3 4 5

Пинцеты, скальпели, лезвия безопасной бритвы, чашки Петри, пробирки или дрозофильные стаканчики, качалка.

Ход работы. Заражение дисков табака производят ночными культурами А.tumеfaciens. В конце рабочего дня чашки со свежей культурой агробактерии засевают приблизительно 5 мл жидкой среды YTG, min A или LB (с добавкой МgSO₄ после автоклавирования). Для культивирования агробактерий на твердых средах (1,5-1,8% агар) можно использовать среды LB с МgSO₄, YTG, YGB (табл. …). Через 13-16 ч после засева и культивирования на качалке можно использовать культуру агробактерии для заражения листовых дисков табака, петунии или других растений, чувствительных к агробактерии.

Трансформация растений агробактерией происходит по раневой поверхности. Поэтому лучше порезать лист так, чтобы раневая поверхность была максимальна. Лист режут на полоски шириной 2-4 мм, можно дополнительно срезать края листа. Для того, чтобы с таким нарезанным листом было удобнее манипулировать, можно не дорезать полоски до конца с одной стороны или не разрезать лист по средней жилке. Тогда при пассировании со среды на среду можно будет переносить весь порезанный лист или его крупные фрагменты. Форма фрагментов листа не важна – можно порезать лист на диски, квадраты, треугольники. Чтобы лист не подсыхал, лучше проводить операцию в небольшом количестве жидкой среды.

Нарезанные листья помещают нижней стороной вверх в чашку Петри с 10 мл жидкой среды МС с гормонами (табл. 2.1); для табака: 0,2 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК; для петунии: 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК или 0,5 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК.

В чашки нужно добавить 0,2-0,5 мл ночной культуры агробактерий, аккуратно перемешать и оставить на двое-трое суток. В качестве контроля используют среду без добавления культуры агробактерий.

Листовые диски отмывают от агробактерий в жидкой среде и переносят на твердую среду MS для стимуляции каллусообразования с добавкой карбенициллина или клафорана (500 мг/л). Если в качестве вектора для трансформации используют штамм с химерным геном Кm^R, то добавляют канамицин в концентрации 50 мг/л. Для образования каллуса используют среду МС с добавками гормонов: для табака 1 мг/л НУК, 0,2 мг/л БАП; для петунии 1мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК. Если для заражения используются штаммы A. rhizogenes или A. tumefaciens дикого типа (С58, А277, А4 и др.), листовые диски помещают на среду МС без гормонов с карбенициллином или клафораном.

Через 10 дней переносят листовые диски табака на среду для регенерации побегов. Используют среду МС со следующими добавками: сахароза (1%), БАП (1 мг/л), карбенициллин или клафоран (200 мг/л), канамицин (100 мг/л). Концентрацию карбенициллина или клафорана в каждом следующем пассаже (до 5-7-го) можно снижать наполовину.

Появившиеся растения-регенеранты укореняют на среде МС с сахарозой (1%), без гормонов, без витаминов.

2.8.2. МЕТОД КОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ

С AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Материалы и оборудование. Культура протопластов растений; стерильные растения; культура Agrobacterium tumefaciens; плазмидная ДНК, содержащая селективный ген под эукариотическим промотором. Ферментные растворы и среды для выделения и культивирования протопластов по стандартным методикам; раствор маннитола (0,4 моль/л), содержащий MgCl₂ (6 ммоль/л); раствор MgCl₂ (0,3 ммоль/л); раствор ПЭГа м.м. 6000 в маннитоле (0,4 моль/л); регенерационная питательная среда R для листьев табака (табл. 2.15); питательная среда YTG (табл. 2.14) для роста бактерий; растворы клафорана (20 мг/мл), карбенициллина (20 мг/мл), канамицин-сульфата (20 мг/мл).

Таблица 2.15. Регенерационная среда (R) для «листовых дисков»,

РН 5,6-5,8

Компоненты	На 1 л
Макро МС Микро МС Fe-хелат Миоинозитол Витамин В₁ Витамин В₆ Сахароза 6-Бензиламинопурин Нафтилуксусная кислота	100 мл 1 мл 5 мл 100 мл 10 мг 1 мг 10 г 1 мг 0,1 мг

Лабораторная посуда и инструменты, необходимые для работы с протопластами и клетками по стандартным методикам. Все вышеперечисленные растворы, материалы, инструменты, за исключением оборудования, используются стерильными.

Ламинарный бокс; инвертированный микроскоп; настольная центрифуга с максимумом ускорения до 1000 g.

Ход работы. Очищенные протопласты табака

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ

ИЗ СТЕРИЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ КАРТОФЕЛЯ

Индуцировать морфогенез из стерильных эксплантов растений можно с помощью внешних и внутренних факторов: света, температуры, состава питательной среды, и в первую очередь – изменения соотношения фитогормонов. Существуют соматический эмбриогенез и органогенез, который подразделяется на стеблевой, корневой, флоральный.

Ход работы. Стерильное растение картофеля вынимают из пробирки в ламинаре и переносят в стерильную чашку Петри или на стерильное стекло. Отрезают от растения листовые пластинки и междоузлия стерильным скальпелем и помещают с помощью пинцета в чашки Петри со стерильной средой. Культивируют по 5 листовых и стеблевых эксплантов. Через две недели отмечают: наличие или отсутствие морфогенетической реакции, тип морфогенеза (стеблевой, корневой), каллусогенез, разрастание экспланта, жизнеспособность экспланта.

Данные заносят в таблицу.

Тип экспланта	Стеблевой морфогенез	Корневой морфогенез	Разрастание экспланта
Междоузлие
Листовая пластинка

Материалы и оборудование. Стерильные растения картофеля. Колбы на 100 мл или чашки Петри со стерильной питательной средой. Стерильные чашки Петри, стерильные скальпели, стерильные пинцеты.

ИНДУКЦИЯ СТЕБЛЕВОГО ОРГАНОГЕНЕЗА

В КУЛЬТУРЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ КАРТОФЕЛЯ

Для индукции органогенеза кусочек каллусной ткани, полученной из стеблевого или листового экспланта стерильного растения картофеля, пересаживают на среду с высоким содержанием цитокининов; для укоренения образовавшихся побегов их пересаживают на среду с повышенным содержанием ауксинов. Индукция морфогенеза и регенерация растений – сложный, часто многоступенчатый процесс. У картофеля его можно подразделить на несколько стадий: индукция зеленых меристематических зон, появление апексов, формирование растения-регенеранта, укоренение регенеранта.

Ход работы. Каллус вынуть из пробирки или чашки Петри на матрасик, разделить его на кусочки размером 5х5 мм и поместить в пробирку со средой для индукции морфогенеза. Пробирку закрыть пробкой и поставить в световую камеру с температурой 20-25⁰С, освещенностью 10 тыс. люкс и влажностью 70%.

Через 1 неделю отметить появление глобул, а через 3-5 недель – меристематических зон ярко-зеленого цвета. Еще через 1-2 недели появляются апексы. Записать количество апексов на каждом каллусе. Апексы превращаются в маленькие побеги. На одном экспланте может появиться до нескольких десятков побегов.

Когда они достигнут высоты 10 мм, их отделяют от каллуса и переносят на среду для укоренения. Через 5-10 дней отметить появление корней.

Материалы и оборудование: пробирки, колба со средой для морфогенеза, длинный пинцет, стерильный матрасик, каллус картофеля в чашке Петри, спиртовка, спички.

Blog

Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии сельскохозяйственных растений Часть

Миоинозитол