Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии сельскохозяйственных растений Часть
| Вид материала | Методические указания |
- Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов очного и заочного, 620.25kb.
- Методические указания Задания к практическим занятиям Контрольные задания, 752.95kb.
- Методические указания к практическим занятиям и индивидуальные домашние задачи по физике, 635.57kb.
- Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям Для студентов агробиологического, 833.58kb.
- Методические указания к изучению курса и практическим занятиям для студентов спец., 914.85kb.
- Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов агрономического, 453.89kb.
- Методические указания к лабораторно- практическим занятиям по курсу «Средства и методы, 473.79kb.
- Методические указания к практическим занятиям для студентов экономических специальностей, 560.21kb.
- Методические указания для доаудиторной подготовки к практическим занятиям по эпидемиологии, 1893.8kb.
- Самостоятельная работа студентов задания к практическим занятиям, 1011.59kb.
2.2.4. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ
ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ
НА ПРИМЕРЕ ЗЕМЛЯНИКИ.
При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин (6-БАП), в результате активации пазушных меристем из одной верхушечной меристемы образуется много стеблевых почек, точки роста вытягиваются, разворачиваются новые листья. Однако укоренения образовавшихся почек на этой среде не происходит. Для укоренеия образовавшихся при микроклональном размножении земляники почек их необходимо пересадить на новую питательную среду, содержащую ауксины.
Материалы и оборудование. Пробирки с конгломератами почек земляники на питательной среде, пробирки со стерильной питательной средой (табл.2.8). Стерильный пинцет, стерильный скальпель, стерильная чашка Петри, спиртовая горелка, 96%-ный спирт, спички, стакан со стерильной водой.
Таблица 2.8. Питательная среда для корнеобр
азования при микроклональном размножении земляники, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л | Компоненты | Содержание, мг/л |
| Макросоли | По Уайту | Никотиновая кислота | 0,5 |
| Микросоли | По Хеллеру | ИУК | 0,5 |
| Цитрат железа | 3,5 | Сахароза | 20000 |
| Аскорбиновая кислота | 1,0 | Агар-агар | 7000 |
| Тиамин | 0,5 | Пиридоксин | 0,5 |
Ход работы. Используют культуру апикальных меристем земляники в возрасте трех-четырех недель после начала культивирования. В стерильных условиях извлекают из пробирки конгломерат почек земляники. Освобождают основание конгломерата от остатков агаризованной питательной среды, промывают его в стерильной воде и переносят в стерильную чашку Петри. Разъединяют с помощью скальпеля конгломерат на отдельные почки и каждую из них переносят пинцетом в пробирки с питательной средой для укоренения (табл. 2.9). Обжигают горлышко пробирки и пробку, закрывают пробкой, оборачивают целлофаном и помещают пробирки в световую камеру с освещенностью 10 000 люкс, температурой +26оС и влажностью 60%.
Таблица 2.9. Среда для укоренения
растений картофеля, рН 5,8
| Компоненты | Содержание, мг/л |
| Минеральные элементы | По Мурасиге-Скугу |
| Тиамин | 1,0 |
| Пиридоксин | 0,5 |
| Сахароза | 5000 |
| ИМК | 0,1 |
| Агар | 7000 |
Через месяц после пересадки почек на среду для корнеобразования проростки можно переводить в нестерильные условия. Обычно растения пересаживают в ящики или горшки, наполненные смесью торфа и песка (3:1), первое время накрывают колпаком из полиэтилена.
2.3. КАЛЛУСНАЯ КУЛЬТУРА
Сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса заключается в том, что выделенный кусочек ткани (эксплант) стерилизуют и переносят на искусственную питательную среду, содержащие минеральные соли, органические вещества, фитогормоны. На такой питательной среде клетки начинают делиться. Различно дифференцированные клетки претерпевают in vitro дедифференциацию и переходят к делению, образуя первичный каллус. Возникший на эксплантах каллус через четыре-шесть недель переносят на свежую питательную среду (субкультивируют). Техника культивирования тканей позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Однако следует помнить, что длительное пассирование каллуса ведет к нежелательным эффектам: изменению плоидности культивируемых клеток, структурным перестройкам хромосом, накоплению генных мутаций, потере морфогенетического потенциала. Поэтому регенерация растений из каллуса нередко приводит к получению организмов с измененной морфологией, характеризующихся низкорослостью, неправильным жилкованием листьев, нарушением расположения листьев, пониженной жизнеспособностью. В связи с этим при использовании культуры каллуса, например, для микроразмножения период неорганизованного роста должен быть сведен к минимуму.
Итак каллус-это неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллуса контролируются фитогормонами группы ауксинов и цитокининов.
Каллусы на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, легко образуются на эксплантах из самых различных органов: из асептически прорастающих семян, отрезков стеблей и корней, изолированных фрагментов паренхимы, тканей клубня, изолированной сердцевины стебля, из листа, зародышей и др. (1,6).
2.3.1. КАЛЛУСНАЯ ТКАНЬ ИЗ ВЗРОСЛОГО РАСТЕНИЯ.
В качестве примера рассмотрим метод получения каллусной ткани из сердцевины стебля табака.
Материалы и оборудование. Взрослые растения табака. Химический стакан с дистиллированной водой, конические колбы на 100 мл со стерильной питательной средой Мурасиге и Скуга. Вата, 96%-ный спирт, 0,1%-ный раствор сулемы или диацид, стаканы со стерильной водой, стерильные марлевые мешочки, стерильный пробкобур, стерильный скальпель, стерильная чашка Петри.
Ход работы. Из стеблей табака в фазе бутонизации или цветения вырезают участки с хорошо развитой, но еще не одревесневевшей сердцевиной (второе-третье междоузлие). Выбранные участки стебля разрезают на части длиной 5 см и моют в мыльном растворе щеткой, затем отмывают от мыла водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Чистые участки стебля помещают в стакан с дистиллированной водой и переносят в ламинар.
Для стерилизации протирают стебли табака 96%-ным спиртом, и погружают в марлевых мешочках в 0,1%-ный водный раствор сулемы на 10-15 мин или в раствор диацида (1:1000) на 25 мин. После стерилизации стебли промывают в пяти порциях дистиллированной воды, оставляя в каждой на 5 мин. Затем из центральной части стебля вырезают стерильным сверлом для пробок (диаметр 5 мм) столбик сердцевиной ткани и помещают в стерильную чашку Петри. Стерильным скальпелем удаляют участки ткани вблизи прежних срезов (концевые участки). Вырезанная сердцевина не должна содержать элементов флоэмы и камбия. Полученные цилиндрики сердцевины разрезают скальпелем в чашке Петри на кусочки длиной 2-3 мм и помещают на поверхность агаровой среды. Посуду с эксплантами табака помещают в термостат (в темноту) при температуре +25оС для культивирования. Через три недели анализируют результаты по образованию каллуса. Таким же образом получают каллус из корнеплодов картофеля и моркови.
2.3.2. КАЛЛУСНАЯ ТКАНЬ ИЗ АСЕПТИЧЕСКИХ
ПРОРОСТКОВ
Каллусную ткань можно получить не только из различных частей нестерильного растения, например из сердцевины табака, но и из асептических проростков или растений. В последнем случае техника получения каллуса весьма проста, так как материал не требует предварительной стерилизации. В данной работе демонстрируется получение каллусной ткани из семядолей стерильных проростков редиса.
Материалы и оборудование. Стерильные проростки редиса. Колбы на 100 мл или чашки Петри со стерильной питательной средой Уайта (табл.2.3). Стерильнфе чашки Петри, стерильные скальпели, стерильные пинцеты.
Ход работы. Стерильные проростки редиса вынимают из чашки Петри или пробирки в ламинаре и переносят в стерильную чашку Петри или на стерильное стекло. Отрезают от проростков стерильным скальпелем семядоли, участки гипокотиля и помещают с помощью пинцета в чашки Петри со стерильной средой Уайта, в состав которой включена 2,4-Д в концентрации 1 мг/л. Через две-три недели зарисовывают образовавшуюся на семядолях и гипокотилях каллусную ткань.
2.3.3. КАЛЛУСНАЯ ТКАНЬ ИЗ ЛИСТЬЕВ АСЕПТИЧЕСКИХ
РАСТЕНИЙ
Каллусную ткань получают из разных частей растения, в том числе и из зеленых листьев. При культивировании клеток листа в темноте возникающая после дедифференцировки клеток каллусная ткань в большинстве случаев теряет зеленую окраску и утрачивает способность к фотосинтезу (3).
Дедифференцировке клеток и переходу к каллусогенезу способствует повреждение тканей, поэтому перед помещением листьев на питательную среду для лучшего образования каллуса их надрезают вдоль жилок.
Материалы и оборудование. Стерильные растения. Чашки со стерильной питательной средой В-5 (табл.2.4), 96%-ный спирт. Стерильные скальпели и пинцеты, стерильные чашки Петри, спиртовая горелка, спички.
Ход работы. В ламинаре, соблюдая стерильность, вынимают растения люцерны из пробирки, отделяют листья и помещают их в чашки Петри. Тройчаты листья разделяют скальпелем на листочки и делают ряд надрезов по всей площади листовой пластинки (вдоль жилок). Помещают листья на агаризованную питательную среду В-5 в чашки Петри.
В качестве источника углеводов в среду добавляют сахарозу (30 мг/л). Доводят рН среды до 6,0. Кроме обычных компонентов в среду В-5 (табл. 2.4) добавляют фитогормоны: 2,4-Д, кинетин по 8,0 мг/л и НУК 0,5 мг/л, и нитрат аммония 250 мг/л, кроме того, втрое увеличивают концентрацию хелата железа (берут 111 мг/л ЭДТА-Na2 и 84 мг/л FeSO4.7H2O).
После помещения экспланта на питательную среду чашки держат в темноте в течение трех недель при температуре +26оС и относительной влажности воздуха 95-100%. Через 7-10 дней экспланты теряют зеленую окраску и становится заметным образование каллусной ткани (сначала по краям надрезов, а затем по всей поверхности листовой пластинки). Через три недели наблюдаются хорошо развитые каллусы.
2.4. РЕГЕНЕРАЦИЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO.
ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ.
Способность каллусных клеток к морфогенезу определяется балансом в них фитогормонов, который зависит, во-первых, от уровня эндогенных фитогормонов, во-вторых, от уровня обеспечения тканей экзогенными регуляторами роста, в-третьих, от способности культивируемых клеток к рецепции и реакции на данные гормональные факторы.
Клетки каллуса обычно не способны к синтезу фитогормонов в оптимальных для размножения количествах и поэтому нуждаются в экзогенных регуляторах роста. В отдельных случаях каллусные клетки, выращиваемые в длительной пересадочной культуре, становятся гормононезависимыми. Возможными причинами гормононезависимых каллусных клонов служат мутации в клеточной популяции с последующей селекцией мутантных клеток и дерепрессия генов, связанных с ситемами биосинтеза фитогормонов.
Существует тесная взаимосвязь между уровнем эндогенных и экзогенных фитогормонов и способностью каллусных клеток к морфогенезу. Каллусные клетки, долго выращиваемые в условиях in vitro, теряют морфогенетический потенциал, что связано с накоплением генетических изменений, чаще всего цитогенетических. Причины цитогенетической изменчивости (полиплоидизация, анеуплоидизация, хромосомные аберрации) культивируемых клеток разнообразны. Можно выделить ряд факторов, ответственных за генетическую изменчивость в культуре клеток: нарушение связи при выделении экспланта из растения; действие компонентов среды; влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа.
Регенерация растений из гетерогенных каллусных клеток в ряде случаев приводит к получению растений с измененной морфологией, кроме того, возможно получение химерных растений. Регенерация может осуществляться вследствие возникновения почек из существующих меристем или в результате редифференциации специализированных клеток, образования меристематических очагов с последующей дифференциацией стеблевых почек. Различие между этими процессами имеет важное значение, так как меристематическое происхождение растений обуславливает их генетическую идентичность родительским формам.
Регенерация in vitro может происходить двумя путями: через побегообразование (часто употребляют термин «стеблевой органогенез») и через соматический эмбриогенез. В процессе побегообразования в каллусе обособляется зона меристемоактивных клеток (их, как правило, восемь-шестнадцать), из которых и формируется растение-регенерант. Обычно побегообразованию предшествует формированию органогенного (эмбриогенного) каллуса со множеством меристемоактивных зон, что сопровождается образованием множества растений-регенерантов в пределах одного каллуса. Образующиеся растения-регенеранты всегда без корней, т.е. требуется дополнительная операция по их укоренению. Отсюда и название «побегообразование», или « стеблевой органогенез», так как формируется неполноценное растение. Кроме того, очень часто при таком способе регенерации возникают химерные растения, если они образуются не из одной клетки, а из группы клеток, в которую могут входить генетически разные клетки.
При соматическом эмбриогенезе зародыши-эмбриоиды развиваются аксесуально вне зародышего мешка из соматических клеток культивируемых in vitro. Этот процесс напоминает зиготический эмбриогенез. Соматический эмбриоид-биполярная структура, в которой одновременно развиваются апексы стебля и корня.
Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа: 1) клетки экспланта дедифференцируются и под влиянием ауксинов превращаются в эмбриональные; 2) при уменьшении концентрации ауксинов или их исключении из питательной среды образуются эмбриоиды из эмбриональных клеток.
В целом для любого типа регенерации in vitro можно выделить четыре группы факторов, определяющих ее успех: 1) генотип и состояние родительского растения; 2) состояние экспланта; 3) особенности введения экспланта в стерильную культуру; 4) условия культивирования. Разные виды растений in vitro способны к определенному типу регенерации. Так, для моркови зарактерен в основном соматический эмбриогенез, а у табака даже в пределах одного каллуса возможны соматический эмбриогенез и побегообразование.
2.4.1. ПАССИРОВАНИЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ.
КРИВАЯ РОСТА КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ
В кривой роста каллусной ткани S–образной формы выделяют начальную фазу (лаг-фазу); фазу логарифмического роста, во время которой идет деление клеток; фазу замедленного роста; стационарную фазу и фазу деградации. Для того, чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, кусочек каллусной ткани переносят на свежую питательную среду. Этот прием поддержания клеточный делений носит название пассирования тканей. Пассировать ткань можно неограниченное число раз.
Пассирование каллуса проводят (в зависимости от интенсивности роста) каждые три-шесть недель. Цикл выращивания обычно продолжается четыре недели. Для построения кривой роста взвешивают каллус четыре раза (каждые пять-семь дней). Для взвешивания берут три-четыре пустые чашки Петри, в каждую помещают по пять-семь эксплантов (100-150 мг). Кроме ростовых характиристик отмечают цвет и консистенцию каллусной ткани. Каллус бывает рыхлый и плотный. Рыхлый каллус быстрее растет и предпочтителен для длительного пассирования и образования суспензии. Плотный каллус используется для морфогенеза. Обычно для инициации морфогенеза в каллусе содержание ауксина в среде должно быть в несколько раз выше, чем для поддержания его роста. Например, для инициации морфогенеза в каллусе в среду добавляют 6 мг/л 2,4-Д, а для поддержания роста (т.е. со второго пассажа) 3 мг/л 2,4-Д.
Материалы и оборудование. Культура каллусной ткани. Чашки со стерильной агаризованной средой, 96%-ный спирт. Стерильный пинцет, стерильный скальпель, спиртовая горелка, спички, стерильная чашка Петри, весы.
Ход работы. Открывают чашку Петри с каллусом. Пинцетом берут каллус, помещают его в стерильную чашку Петри и определяют массу каллуса с помощью торзионных весов. После взвешивания каллус разделяют скальпелем на кусочки 100-150 мг и помещают в чашки Петри, по пять кусочков в каждую. Чашки ставят в термостат с температурой +25оС. Через неделю операцию повторяют. Через четыре недели строят кривую роста. Подсчитывают индекс роста: масса в конце пассажа/масса в начале пассажа.
Для пассирования каллуса, соблюдая стерильность, переносят каллус в чашку Петри. Отделяют старые некротизированные. Затем делят каллус на равные кусочки и переносят их на стерильную питательную среду. Затем чашки помещают в термостат с температурой +25оС и влажностью 60% на три-шесть недель. В конце срока следует вновь провести пассирование.
Состав среды для поддержания роста каллусной ткани видоспецифичен. Например, для каллуса люцерны используют среду В-5 (табл. 2.4).
2.4.2. СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ
В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ
Регенерацию in vitro рассмотрим на примере соматического эмбриогенеза у люцерны. Переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани зависят от соотношения гормонов в питательной среде. Преобладание цитокининов над ауксинами приводит к индукции стеблевого органогенеза или к соматическому эмбриогенезу. Преобладание ауксинов над цитокининами способствует образованию корней в каллусной ткани-корневому органогенезу (1).
В каллусной ткани люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), индуцируется образование почек и эмбриоидов. Через две-три недели от начала действия индуктора морфогенеза на каллусах развиваются зеленые почки и эмбриоиды длиной 0,5-2,0 мм. Их образованию предшествует возникновение на светлой поверхности каллусов зеленых точек, которые появляются через несколько дней после пересадки. Эмбриоиды в основном образуются у тетраплоидных сортов и у гибридов люцерны, почки чаще формируются у диплоидных форм. Иногда почки и эмбриоиды могут развиваться одновременно на одном каллусе.
Для получения растений-регенерантов возникшие почки и эмбриоиды помещают на среду без гормонов, где через две-три недели формируются растения. Иногда наблюдается нарушение нормального развития растений (образование каллуса, преимущественное развитие корня и побега, утолщение различных органов). В этом случае материал следует пересадить на среду без гормонов, с уменьшенной вдвое концентрацией всех компонентов. Срок, необходимый для прохождения всех стадий регенерации растений из тканевых культур (от листового экспланта до регенеранта), составляет около двух месяцев.
Материалы и оборудование. Культура каллусной ткани, полученной из листа люцерны. Колбы на 50 мл со стерильной питательной средой В-5 (табл.2.4). Стерильная чашка Петри, стерильные скальпели.
Ход работы. Соблюдая стерильность, каллус переносят в чашку Петри, разделяют на кусочки размерами 5х5 мм и помещают на новую питательную среду В-5 с добавкой 6-БАП (0,2 мг/л). Эта среда стимулирует развитие в каллусной ткани клеток меристематического и эмбрионального типа, из которых в дальнейшем формируются почки и эмбриоиды. Пересаженные каллусы ставят для инкубации в световые камеры (16 ч освещения). Через три недели наблюдают развитие зеленых почек и эмбриоидов. Полученные эмбриоиды и почки используют для получения растений-регенерантов. Их переносят с соблюдением строгой стерильности на питательную агаризованную среду В-5 без гормонов и инкубируют в световой камере. В одну колбу на 50 мл с 25 мл среды следует высаживать четыре-шесть почек эмбриоидов. Через три недели отмечают образование побегов из почек и формирование растений-регенерантов. На одном экспланте может появиться до нескольких десятков побегов. Когда побеги достигают высоты 10 мм, их следует разделить и перенести на среду для укоренения: В-5 с добавлением нафтилуксусной кислоты (НУК) концентрацией 0,1 мг/л. Через 5-10 дней отмечают появление корней.
2.5. СУСПЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА
Клеточная суспензия – источник ценных биологически активных веществ, служит исходным материалом для клеточной селекции. Суспензионная культура может быть использована как модельная система для изучения путей вторичного метаболизма, синтеза ферментов, экспрессии генов.
Получение экономически важных веществ растительного происхождения в пробирочной культуре связано со способностью культивируемых клеток многих растений синтезировать различного рода продукты, которые обычно получают из целых растений. При этом появляется возможность создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные. Клеточные культуры – продуценты имеют определенные преимущества перед традиционным растительным сырьем, так как продукт можно получать независимо от ареала распространения растения, сезона, погоды, почвенных условий.
Культура клеток позволяет оптимизировать и стандартизировать условия выращивания и, следовательно, автоматизировать технологический процесс. Если к тому же учесть быстрое истощение естественных сырьевых ресурсов, то преимущества использования клеточных технологий становятся очевидными.
В культуре клеток могут синтезироваться специфические для высших растений экономически важные соединения: алкалоиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, терпеноиды и терпены, эфирные масла, стероиды, пряности, инсектициды, натуральные красители и многие другие ценные вещества (6). Так у нас в стране налажено промышленное производство биомассы ценного лекарственного растения женьшеня. Из 0,1 г экспланта женьшеня за 1,5 месяца культивирования in vitro получают до 5 г ткани. Средний прирост корня женьшеня в оптимальных условиях на плантациях за год достигает лишь 8 г. Следовательно, культивирование in vitro, несомненно, является рентабельным производством. По качеству экстракты, полученные из каллусной ткани, почти не отличаются от экстрактов из натурального корня женьшеня.
В Японии ведется промышленное производство суспензии воробейника-продуцента лекарственного вещества шиконина, а также суспензии табака с целью получения убихинона. В Германии разработан способ получения алкалоидов N-метилтриптомина и горденина из суспензионной культуры ячменя.
Для повышения эффективности синтеза вторичных соединений используют химический и радиационный мутагенез, что приводит к возникновению наследственных изменений в клетках. Например, в Институте физиологии растений РАН получены мутантные клеточные линии раувольфии змеиной, которые приобрели способность продуцировать в 10 раз больше ценного для медицины антиаритмического алкалоида аймалина, по сравнению с исходными клетками. Получены высокоэффективные штаммы клеток руты душистой, синтезирующих алкалоид рутаридон, штаммы диоскореи дельтовидной, продуцирующей диосгенин, который необходим для синтеза гормональных препаратов.
В литературе имеются данные по биотрансформации химических соединений растительными клетками in vitro. Так, например, если в суспензионную культуру лекарственного растения наперстянки шерстистой добавить гликозид диготоксин, то клетки способны преобразовать его в дигоксин-более ценный для медицины продукт. Возможна биоконверсия морфина в суспензионной культуре клеток гингко в два новых алкалоида, одним из которых является кодеин.
Сейчас в разных странах в культуре выращивают более полусотни различных видов растений, среди которых агава, белладонна, ландыш майский, дурман обыкновенный, наперстянка душистая, дискорея дельтовидная, женьшень, табак, раувольфия, змеиная, клещевина, катаранус розовый. Отметим, что гликозиды, полученные в пробирочной культуре, более активны, чем гликозиды из надземных частей обычных растений. Промышленное выращивание суспензионных культур перспективно не только для получения веществ, синтезируемых растениями, но и для поиска новых продуктов синтеза с принципиально иным типом действия, чем уже известные продукты растений.