Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии сельскохозяйственных растений Часть
| Вид материала | Методические указания |
- Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов очного и заочного, 620.25kb.
- Методические указания Задания к практическим занятиям Контрольные задания, 752.95kb.
- Методические указания к практическим занятиям и индивидуальные домашние задачи по физике, 635.57kb.
- Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям Для студентов агробиологического, 833.58kb.
- Методические указания к изучению курса и практическим занятиям для студентов спец., 914.85kb.
- Методические указания к лабораторно-практическим занятиям для студентов агрономического, 453.89kb.
- Методические указания к лабораторно- практическим занятиям по курсу «Средства и методы, 473.79kb.
- Методические указания к практическим занятиям для студентов экономических специальностей, 560.21kb.
- Методические указания для доаудиторной подготовки к практическим занятиям по эпидемиологии, 1893.8kb.
- Самостоятельная работа студентов задания к практическим занятиям, 1011.59kb.
2.5.1. ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ
ИЗ КАЛЛУСА
Суспензия представляет собой одиночные клетки и агрегаты, которые растут в жидкой питательной среде определенного состава в стерильных условиях. Существуют разные способы культивирования суспензии: в колбах на качалках, ферментерах. Необходимое условие роста суспензии состоит в перемешивании или встряхивании среды, что обеспечивает аэрацию культур. Обычно суспензию получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, но без агара. Растительные суспензии характеризуют по следующим показателям: количество жизнеспособных клеток, сегрегированность суспензии и плотность клеток в суспензионной культуре.
Материалы и оборудование. Каллусы. Колбы с жидкой питательной средой. Пинцеты, скальпели, стерильные чашки Петри, спиртовка, спички.
Ход работы. Открывают чашку Петри с каллусом, стерильным пинцетом выкладывают кусочки рыхлого каллуса в стерильную чашку Петри, отбирают светлые участки и опускают их в колбочки со стерильной средой для суспензии. Расчет навески каллуса на объем жидкости делается следующим образом: 3-5 г каллуса на 100 мл жидкости. Объем суспензии составляет 10-20% объема колбы. Например, в колбу объемом 500 мл наливают 50-100 мл суспензии. Закрывают колбу ватно-марлевой пробкой с целлофаном или фольгой и ставят на качалку на три-четыре недели (оптимальная длительность одного пассажа).
2.5.2.ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК И СТЕПЕНИ
АГРЕГИРОВАННОСТИ СУСПЕНЗИИ
Суспензия состоит из одиночных клеток и агрегатов, называемых культивируемыми единицами. Для определения жизнеспособности клеток и агрегатов применяют пожизненную окраску суспензии. Живые клетки не окрашиваются, в них видно движение цитоплазмы, в них видно движение цитоплазмы. В мертвые клетки краска проникает, они окрашиваются в темно-синий цвет.
Материалы и оборудование. Колбочка с суспензией. Краситель – 0,1%-ный раствор синей Эванса или метиленовой синей. Стерильные пипетки с отрезанным концом, резиновая груша, пенициллиновый пузырек, предметные стекла, стеклянные палочки, камера для подсчета элементов крови, микроскоп.
Ход работы. Для подсчета жизнеспособных клеток на предметное стекло наносят каплю суспензии, рядом каплю краски. Смешивают их стеклянной палочкой. Существует следующее правило для оценки жизнеспособности агрегата: если половина (50%) или большое количество клеток в агрегате не окрашивается, он считается живым. Просматривают под микроскопом в сумме не менее 1000 культивируемых единиц. Вычисляют процент жизнеспособных клеток. Записывают результаты каждого подсчета.
Для определения степени агрегированности анализируют каплю суспензии на предметном стекле под микроскопом. Обычно подсчитывают одиночные клетки, агрегаты от 2 до 5 клеток, от 6 до 20, от 21 до 50, больше 50 клеток, т.е. выделяют пять груш культивируемых единиц. Анализируют не менее 1000 культивируемых единиц, используют счетчик. Результаты записывают в таблицу:
| Число культивируемых единиц | Количество клеток в агрегате | ||||
| | 1 | 1-15 | 20 | 21-50 | >50 |
2.5.3. ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИОННОЙ
КУЛЬТУРЕ
Одним из основных показателей, характеризующих суспензию, служит плотность клеточной популяции. Число клеток определяют после мацерации (разделения клеток) суспензии. Подсчет клеток ведется в счетной камере под микроскопом. В качестве мацерирующего вещества применяется 10-20%-ная хромовая кислота, которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки. После мацерации для лучшего отделения клеток друг от друга их надо несколько раз пропустить через шприц с толстой иглой. Затем клетки считают. После добавления к суспензии хромовой кислоты смесь ставят в термостат при температуре 60С на 10-30 мин. Время нагревания зависит от особенностей суспензии (агрегированности, химического состава клеточных стенок и т.д.). Обычно различают три фазы ростового цикла суспензии: лаг-фазу (2-3 сут), фазу экспоненциального роста (2-10 сут) и стационарную фазу (10-15 сут). Хорошо растущая суспензия имеет S-образную кривую роста. Длительность цикла роста определяется временем до выхода культуры в стационарную фазу. Продолжительность фаз зависит от вида растения и органа, из которого получена, из которого получена культура каллуса, а затем суспензия, от начального количества клеток (первичного инокулята), от условий выращивания. Обычно длительность пассажа (время до пересадки) составляет 14-16 дней. При этом плотность возрастает от 5.104-105 кл/мл до 106-5.106 кл/мл (примерно в 20 раз). Для субкультивирования (пересадки) суспензия берется в конце экспоненциальной фазы. Для каждой культуры надо подбирать условия, при которых рост суспензии оптимален: реализуется S-образная кривая при высокой (70-80%) жизнеспособности.
Материал и оборудование. Колбочка с суспензией. 20-% хромовая кислота. Стерильные пипетки с отрезанным кончиком, резиновая груша, пеницилиновые пузырьки, пипетка с оттянутым носиком, камера Фукса-Розенталя (гемоцитоиетр), камера для подсчета элементов крови, микроскоп, покровные стекла, шприц с толстой иглой.
Ход работы. Отбирают пипеткой со срезанным кончиком несколько миллилитров суспензии, предварительно взболтав суспензию в колбе. Для построения ростовой кривой используют по 20 мл суспензии из трех колбочек. Их сливают в одну емкость и все операции проделывают из смешанной суспензии. К одному объему исследуемой суспензии добавляют два объема хромовой кислоты и ставят при 600С на 10 мин. Затем пропускают смесь через шприц с большой иглой три раза, при этом клетки хорошо отделяются друг от друга.
Камеру Фукса-Розенталя и покровное стекло тщательно промывают, высушивают. Притирают покровное стекло к камере до появления колец Ньютона. Пипеткой с узким носиком набирают мацерированный раствор и подносят к краю покровного стекла, при этом жидкость заполняет весь объем камеры. Подсчитывают клетки под микроскопом, в четырех больших квадратах по диагонали или по всей камере. При каждом заполнении считают верхнюю и нижнюю сетки. Операцию подсчета выполняют три-четыре раза. Для получения достоверных данных считают до 1000 клеток.
Для построения S-образной кривой показатели снимают через день в процессе культивирования. Плотность суспензии подсчитывают по формуле:
х = М . n .1000 / 3,2,
где х – число клеток в 1мл, М – среднее число клеток в камере, n - разведение.
2.5.4. ПАССИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ
Длительность первого цикла выращивания суспензии зависит от вида растения, состава питательной среды, условий выращивания, но обычно не превышает четырех недель. При пассировании срок культивирования уменьшается до двух недель. За это время часть клеток отмирает, происходит интенсивное деление живых клеток. Суспензию надо пересаживать после появления на поверхности колбы ободка из живых клеток.
Материалы и оборудование. Колбочка с суспензией, колбочка со стерильной средой для пассирования суспензии. Стерильные пипетки с отрезанным концом, резиновая груша, спиртовка, спички.
Ход работы. Пересев суспензии можно осуществить несколькими способами:
1)суспензии дают отстояться одну-две минуты, чтобы осели крупные агрегаты; стерильной пипеткой берут несколько миллилитров суспензии из верхней части ее объема;
2)профильтровывают суспензию через капроновую ткань или нейлоновый фильтр и к профильтрованной части добавляют свежую среду;
3)дают отстояться суспензии одну-две минуты и отливают 5-10 мл в колбу со свежей средой.
Горлышко колбы необходимо обжигать над пламенем спиртовки до и после пересадки.
Обычно для хорошо растущей суспензии используют разведение 1:10, т.е. в колбу на 500 мл помещают 5 мл суспензии и 45 мл свежей среды. Более точно разведение должно определяться на основе ростовых характеристик.
2.5.5. ВЫСЕВ СУСПЕНЗИИ
В ТВЕРДУЮ АГАРИЗОВАННУЮ СРЕДУ
(МЕТОД ПЛЕЙТИНГА)
Для проведения клеточной селекции обычно применяют высев мелкоагрегированной суспензии в агаризованную среду (2). При этом одиночные клетки и мелкие агрегаты дают начало клеточным клонам. Конечная цель клеточной селекции-получение растений из клеточных клонов.
Материалы и оборудование. Суспензия, среда для высева суспензии с двойным содержанием агара (1,2-1,4%). Стерильные чашки Петри, стерильный цилиндр.
Ход работы. Суспензию наливают в стерильный цилиндр и дают ей отстояться в течение 5 мин. Отбирают пипеткой 5 мл верхней фракции суспензии (обогащенной одиночными клетками) и смешивают в чистом стерильном цилиндре с 5 мл теплой питательной среды для роста каллуса. Быстро разливают содержимое цилиндра в чашки Петри, дают застыть и закрывают парафилмом. Через три-пять недель подсчитывают колонии диаметром более 1 мм. Эффективность высева определяется отношением количества образовавшихся колоний к количеству высеянных клеток и выражается в процентах. Обычно плотность высева составляет 105 кл/мл. Она не должна быть очень высокой, чтобы растущие колонии не сливались. Через три недели подсчитывают количество колоний в каждой чашке.
2.6. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ
Протопласт-это живое содержимое клетки, лишенное пектоцеллюлозной оболочки. Протопласты способны осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтезы. Впервые выделение протопласта было осуществлено механическим способом в связи с изучением плазмолиза Дж.Клеркером в 1892г. Механическим способом можно выделить небольшое количество протопластов. Кроме того, этим методом трудно получить протопласты из меристематической или зрелой ткани. Другой метод получения изолированных протопластов – энзиматический. В этом случае для удаления клеточной стенки используют пектолитические и целлюлолитические ферменты. Осмотические стабилизаторы: Д-маннит, Д-сорбит, сахарозу и глюкозу, применяют для выравнивания давления внутри иклетки и вне ее. Концентрацию осмотических стабилизаторов подбирают для конкретного вида растения и его физиологического состояния. По сравнению с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества: 1)одновременно можно выделить большое количество протопластов; 2)протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3)метод сравнительно быстрый. Изолированные протопласты выделяют из тканей различных органов высших растений: корней, листьев, цветков, плодов, опухолей различного происхождения. Для получения протопластов используют клеточные суспензии и каллусные культуры, в этом случае нет необходимости в стерилизации исходного материала. Сразу после удаления раствора фермента у протопластов начинается образование клеточной стенки. После регенерации клеточной стенки образовавшиеся клетки могут начать деление. Через некоторое время они образуют микроколонии, состоящие из 20-40 клеток. Затем из микроколоний образуются нормальные, хорошо развитые пролиферирующие каллусные ткани. Из каллуса можно получить растение-регенерант, что свидетельствует о тотипотентности протопласта.
Несмотря на то что выделение протопластов технически хорошо отработанная процедура, получить жизнеспособные протопласты непросто. Это зависит от многих факторов: состава ферментов, их качества, рН среды и выбора осмотического раствора и др. Большое значение имеет физиологическое состояние растительного материала, его возраст, условия выращивания.
2.6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ:
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ
И ФЕРМЕНТАЦИЯ ТКАНЕЙ
Клеточные оболочки у растений представлены главным образом целлюлозой, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами. Поэтому для разрушения оболочки используют ферментные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом. Для ферментации используют молодые листья, предварительно осажденную суспензионную культуру или каллусные ткани, растущие на агаре.
Длительность ферментации зависит от типа ткани, состава ферментных растворов, температуры инкубации. Ферментацию следует контролировать визуально, используя инвертированный микроскоп. В связи с этим ферментацию лучше проводить в чашках Петри. Если ферментацию выполняют в течение ночи, то следует использовать менее концентрированные смеси, если в течение рабочего дня-более концентрированные. Рассмотрим технику выделения протопластов из мезофилла листа табака.
Материалы и оборудование. Асептические растения. Стерильные среды (табл.2.10.), ферменты. Чашки Петри диаметром 10 см, колбы на 50 мл, пастеровские пипетки, колбочки со стеклянными воронками и нейлоновыми фильтрами с диаметром пор 60 мкм, мерные пипетки на 1 и 10 мл, центрифужные пробирки на 10 мл, шприц с насадкой для фильтров «Миллипор» и фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, пинцеты, скальпели, настольная центрифуга, инвертированный микроскоп.
Ход работы. За сутки до опыта готовят ферментный раствор для выделения протопластов из мезофилла листа. Ферментная смесь содержит 0,5%-ную целлюлозу, 0,5%-ную мацеразу, 0,2%-ную дреселлазу, которую растворяют в растворе сахарозы (0,5 моль/л) и CaCl2 (50 ммоль/л), рН 5,5-5,6. Приготовленный раствор центрифугируют для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 1,5-2 g. После доведения рН до 5,5-5,6 раствор при помощи шприца с насадкой фильтруют через фильтр «Миллипор» в чашки Петри по 7-10 мл в каждую.
Молодые листья табака от растений, выращенных в асептических условиях, переносят в стерильные чашки Петри и нарезают узкими полосками или елочкой. Затем листья сразу помещают на поверхность ферментного раствора. Чашки переносят в термостат при 28-300С на 15-18 ч. Для 1 г ткани достаточно 10 мл ферментного раствора. Контроль за ферментацией осуществляют с использованием инвертированного микроскопа. Аналогичным об
Таблица 2.10. Среды для культивирования протопластов табака
и картофеля, рН 5,7
| Компоненты, мг/л | W-5 | K-3 | W-S-S | SH-1 | SH-2 | RMOP |
| NaCl | 9000 | | | | | |
| NH4NO3 | | 250 | 1280 | | | 1650 |
| KNO3 | | 2500 | | 1900 | 1900 | 1900 |
| CaCl2 . 2H2O | 18400 | 900 | 600 | 440 | 440 | 440 |
| MgSO4 . 7H2O | | 250 | 300 | 370 | 370 | 370 |
| KH2PO4 | | | 170 | 170 | 170 | 170 |
| KCl | 800 | | 300 | | | |
| NaH2PO4 . H2O | | 150 | | | | |
| (NH4)2SO4 | | 134 | | | | |
| NH4Cl | | | | 267 | 267 | |
| Fe-хелат | | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| H3BO3 | | 3 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| MnCl2 . 4H2O | | | 24 | 24 | 24 | 24 |
| ZnSO4 . 7H2O | | 2 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CuSO4 . 5H2O | | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 |
| CoSO4 . 7H2O | | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 | 0,025 |
| Ki | | 0,75 | 0,83 | 0,83 | 0,83 | 0,83 |
| Na2МoO4 . 2H2O | | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| MnSO4 . 7H2O | | 14 | | | | |
| Мезоинозит | | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Глицин | | | | 2 | 2 | |
| Никотиновая кислота | | 1 | 1 | 5 | 5 | |
| Фолиевая кислота | | | | 0,5 | 0,5 | |
| Биотин | | | | 0,05 | 0,05 | |
| Аденинсульфат | | | | 40 | 80 | |
| Гидролизат казеина | | | 500 | 300 | 100 | |
| В1 | | 10 | 10 | 0,5 | 0,5 | 10 |
| В6 | | 1 | 1 | 0,5 | 0,5 | 1 |
| НУК | | 0,2 | 2 | 0,1 | | |
| ИУК | | | | | 0,1 | 0,1 |
| 2,4-Д | | 1 | 0,2 | | | |
| БАП | | 0,2 | 0,5 | 0,5 | | 1 |
| Зеатин | | | | | 0,5 | |
| Сахароза | | 10000 | | 2500 | 2500 | 10000 |
| Глюкоза | 1000 | | 7200 | | | |
| Ксилоза | | | 250 | | | |
| Маннитол | | 72800 | | 54600 | 34600 | |
разом можно провести ферментацию из растений любых видов, но при этом следует изменить состав раствора. Так, для выделения протопластов из мезофилла картофеля применяют смесь, состоящую из 1%-ного целлюлазина, 0,5%-ной мацеразы и 0,1%-ной дреселлазы. После ферментации содержимое чашки фильтруют через нейлоновый фильтр в пустую стерильную колбу. Затем пипеткой суспензию, содержащую протопласты, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 1g. Протопласты всплывают на поверхность. Их отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, заполненную до половины средой W-5 (табл.2.10). Протопласты центрифугируют в этой среде 2мин при 700 g, для того чтобы отмыть от остатков ферментной смеси. Отмывку проводят дважды. При центрифугировании в питательной среде W-5 протопласты осаждаются. Это последний этап в процессе их выделения. В некоторых случаях рекомендуют центрифугирование смеси в градиенте сахарозы, тогда протопласты формируют кольцо на поверхности среды. Отбирают их также пастеровской пипеткой.
2.6.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЗОФИЛЛА ЛИСТА
Растительные протопласты, высеянные на питательную среду, через три-четыре дня регенерируют клеточную оболочку и переходят к делению. К 12-14-му дню практически все клетки, начавшие делиться, превращаются в микроколонии. Сосотоящие из 20-40 клеток микроколонии переносят на среду для подращивания, где они превращаются в хорошо пролиферирующие каллусные ткани. Из каллусов можно получить растения-регенеранты. Сегодня выделение протопластов, их культивирование и регенерацию целых растений успешно осуществляют для видов семейства пасленовых (2). Если культивирование протопластов проходит успешно независимо от освещения, то для регенерации из них растений обязательно нужен свет.
Материалы и оборудование. Суспензия отмытых протопластов. Стерильные среды (табл.2.10). Чашки Петри диаметром 6 см, пастеровские пипетки, мерные пипетки на 1 и 10 мл, инвертированный микроскоп, камера Горяева или Фукса-Розенталя.
Ход работы. В стерильных условиях пастеровской пипеткой отбирают сверху среду W-5. Осадок протопластов ресуспендируют в 0,5 мл среды К-3 (табл. 2.10). В чашку Петри наливают с помощью мерной пипетки 6-10 мл среды К-3 и туда переносят пипеткой суспензию протопластов. Перед высевом протопластов на среду К-3 для культивирования следует определить их плотность с помощью камеры Фукса-Розенталя. Оптимальная плотность высева составляет 103 клеток в 1 мл.
Культивирование протопластов проводят на рассеянном свету или в термостате при температуре 26-280С. Каждый день нужно проверять качество протопластов и контролировать их деление с помощью инвертированного микроскопа.
Через 10-20 дней культивирования протопласты образуют колонии клеток. К этому времени их можно различить глазом как светлые агрегаты. На 20-й день добавляют свежую среду. Для этого готовят несколько чашек диаметром 6-10 см со свежей средой К-3, куда пипеткой с широким концом вносят культуру протопластов.
Через три недели колонии переносят на твердую среду для регенерации из них растений. Чашки с культурой помещают на досветку. Для регенерации табака используют среду RMOP (табл.2.10). Для картофеля при культивировании протопластов используют среду W-S-S, а регенерацию осуществляют последовательно на средах SH-1 и SH-3 (табл.2.10).
2.6.3. ИНДИВИДУАЛЬНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
ПРОТОПЛАСТОВ В МИКРОКАПЛЯХ
Методы культивирования клеток и протопластов растений разработаны в основном для массового культивирования, т.е. выращивания больших количеств клеток в общем объеме питательной среды. Между тем появляется все больше работ, где решающую роль играет индивидуальное культивирование клеток в микрообъеме среды. Такой подход применяется для культивирования гибридных продуктов, инъецированных протопластов. Культивирование небольших количеств клеток в микрообъеме питательной среды оказывается полезным при изучении их жизнедеятельности.
Протопласты и единичные клетки растений хорошо растут при определенной плотности высева. Если плотность менее 103 клеток на 1 мл среды, то происходит заметная диффузия в среду промежуточных продуктов их метаболизма, что часто приводит к гибели клеток. Обычно протопласты растений культивируют при плотности 104-105 на 1 мл, а индивидуальное культивирование протопластов проводят в микрокаплях объемом 10-100 нл.
При индивидуальном культивировании протопластов на покровное стекло наносят микрокаплю раствора сахарозы (2 моль/л) объемом 1 мкл. Затем стекло силиконизируют, а сахарозу удаляют, промывая стекло в воде. Потом наносят микрокаплю парафинового масла (1мкл), под которую вносят микрокаплю питательной среды для культивирования протопластов объемом до 100 нл. В микрокаплю питательной среды вносят один протопласт при помощи микропипетки. Обычно «рассаживают» по каплям не менее 30 протопластов в час. Выживаемость протопластов составляет до 60-90%.
Материалы и оборудование. Те же, что и для ведения культуры протопластов. Ламинарный бокс (установка обеспыливания УО-БГ или аналогичный; инвертированный микроскоп; манипулятор Фонбрюнна; прибор для вытягивания капилляров ПВК-1; микрокузница МЭ-4; микроаппликатор; стеклянные трубки; тефлоновый шланг; держатели капилляров из комплекта КМ-2; парафиновое или вазелиновое масло.
Ход работы. При подготовке опытов особое внимание следует обратить на чистоту посуды и реактивов. Чтобы не засорить микропипетку, все среды желательно профильтровать и тем самым удалить мелкие частички. Для соблюдения стерильности работы нужно проводить в ламинарном боксе, куда помещается вся установка. Сначала выполняют подготовительные операции.
Выделение протопластов проводится по стандартным методикам.
Изготовление микропипеток: на микрокузнице МЭ-4 тонкостенные капилляры диаметром 1,5 мм вытягивают до диаметра около 100 мкм на приборе ПВК-1. Кончик микропипетки изгибают.
Приготовление масла: парафиновое или вазелиновое масло заливают в делительной воронке деионизированной водой в соотношении 1:1. Воронку встряхивают до получения тонкой эмульсии и оставляют в вертикальном положении для отстаивания. Воду, собравшуюся внизу, сливают. Процедуру выполняют пять раз. Затем масло центрифугируют для удаления мельчайших капелек воды (120 мин при 20 тыс. об/мин на роторе SW-27). Масло отбирают, стерилизуют 2 ч при 1200С. После охлаждения в масло стерильно добавляют 0,1-0,2 объема среды для культивирования протопластов. Сосуд с маслом и средой встряхивают для получения суспензии. После отстаивания можно добавить 1-2% стерильного активированного угля. Приготовленое таким образом масло можно хранить в холодильнике при 40С в течение месяца.
Подготовка камеры для индивидуального культивирования: чашку Петри перед опытом заполняют приготовленным масло на 3-4 мм высоты. В чашку вносят каплю среды для культивирования и каплю суспензии протопластов. Объем капель не должен превышать 100 мкл, чтобы они не выступали над поверхностью масла. Камеру закрепляют в препаратоводителе инвертированного микроскопа.
Затем переходят к основным операциям. Стерильная пипетка устанавливается в держатель из комплекта КМ-2, закрепленный на головке манипулятора Фонбрюнна. Держатель и примыкающую часть микропипетки протирают 70%-ным этиловым спиртом. Микропипетку вводят в поле зрения микроскопа. Затем заполняют микропипетку маслом из камеры, а попавший при этом в шланги воздух стравливают через краник.
После этого в микропипетку набирают 10-20 мкл среды из капли под маслом и при помощи микроаппликатора или шприца на 20 мкл на дно камеры вносят микрокапли. Объем микрокапель определяют по формуле для объема полусферы
V= 2\3 п R3
где R – радиус микрокапли, а V – ее объем. Так, для капли объемом 10 нл диаметр равен 342 мкм. Чтобы придать микрокаплям форму полусферы, лишнюю среду отсасывают микропипеткой.
Рассаживание протопластов по каплям выполняют следующим образом. Передвигая масляную камеру при помощи препаратоводителя, приподнятую микропипетку вводят в каплю с суспензией протопластов. Микропипетку размещают над выбранным протопластом, обдувают его средой и засасывают, используя микроаппликатор или шприц на 20 мкл. Для ускорения работы можно набирать в микропипетку до 10 протопластов. После этого микропипетку приподнимают и выводят из капли с суспензией.
При помощи препаратоводителя в поле зрения микроскопа вводят микрокаплю, размещают над ней микропипетку с протопластом и опускают ее до соприкосновения с мениском. С помощью микроаппликатора протопласт выпускают в микрокаплю и отбирают из нее избыток среды. Все вышеописанные операции выполняются при 100-кратном увеличении.
Примерно раз в неделю микроколониям нужно менять среду. Для этого микропипетку заполняют маслом, как описано выше; в камеру вносят каплю свежей среды ( если ее состав отличается от используемой вначале). Часть старой среды из микрокапель забирают в микропипетку и сливают в каплю со старой средой или в каплю с суспензией. Затем микропипетку заполняют свежей средой и доливают микрокапли.
2.7.СЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ, МЕХАНИЧЕСКАЯ ИЗОЛЯЦИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЕДИНИЧНЫХ ГЕТЕРОКАРИОЦИТОВ
Все работы по созданию новых, более совершенных растительных форм до последнего времени проводили лишь путем полового скрещивания растений и последующего отбора желаемых генотипов. Это накладывает ряд ограничений как на возможности комбинирования генов, так и на скорость селекционного процесса. Разработанная за последнее время технология соматической гибридизации высших растений путем слияния протопластов и регенерации продуктов слияния до целых растений позволяет обойти часть ограничений, свойственных половому процессу, и открывает заманчивые перспективы перед генетиками, физиологами, биохимиками растений и селекционерами. Применение методов соматической гибридизации позволяет успешно преодолевать естественную нескрещиваемость филогенетически отдаленных видов растений и, кроме того, создавать дополнительные резервы наследственной изменчивости. К настоящему времени опубликовано более 1000 работ, где описаны результаты изучения различных соматических гибридов. Можно выделить три основных направления исследований по соматической гибридизации высших растений:
1)изучение и реконструкция плазмагенов;
2)исследования по гибридизации клеток филогенетически отдаленных видов растений;
3)получение гибридного материала, представляющего практический интерес для селекционеров.
2.7.1. МЕТОД МЕХАНИЧЕСКОЙ ИЗОЛЯЦИИ
ПРОДУКТОВ СЛИЯНИЯ
В зависимости от поставленной задачи исследователем могут быть использованы самые разнообразные методы селекции соматических гибридов. Ниже будет рассмотрен лишь метод механической изоляции индивидуальных продуктов слияния с последующим их культивированием- прием, не связанный с выраженным отбором тех или иных рекомбинантных форм из общего спектра возникающих при слиянии клеток протопластов.
Материалы и оборудование. Асептически выращиваемые растения, каллусные культуры. Ферментные смеси и среды для выделения протопластов по стандартным методикам, раствор маннитола (0,45 моль/л), раствор сахарозы (0,5 моль/л), раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) (табл. 2.11), буферный раствор (табл. 2.12), питательные среды МО-1 (табл. 2.13). Ламинарный бокс, инвертированный микроскоп, центрифуга на 1000 об/мин, полуавтоматическая микропипетка на 1 мкл, чашки Петри, чашки Купрука, наконечники для микропипеток, лабораторная посуда и инструменты для выделения и культивирования протопластов по стандартным методикам
Все перечисленные растворы, материалы и инструменты используются стерильными.
Ход работы. В опытах по соматической гибридизации с дальнейшей механической изоляцией гибридов необходимо научиться четко, однозначно идентифицировать гибридные клетки, находящиеся в смеси с родительскими партнерами. Для таких опытов обычно используют партнеров, обладающих визуальными маркерами, например каллусные протопласты (богатые цитоплазмой с ярко выраженными цитоплазматическими тяжами и хорошо видимым ядром) и мезофильные протопласты (с зелеными пластидами, малым количеством цитоплазмы, большими вакуолями).
Источником каллусных протопластов могут быть как свежеиндуцированные (один-два пассажа), так и длительно выращиваемые каллусные ткани, предварительно прошедшие два-три пассажа на агаризованных или жидких питательных средах в темноте при 25-280С. Материалом для получения мезофильных протопластов могут служить листья растений, растущих в поле или в теплице, в последнем случае необходима их стерилизация. Более удобны для работы листья асептически выращиваемых в вегетативной комнате растений. Состав питательных сред для культивирования растительного материала, а также условия освещенности асептически выращиваемых растений играют существенную роль для успешного ферментативного выделения и последующей способности к клеточному делению полученных протопластов. Условия обычно подбираются исследователем экспериментальным путем.
В качестве осмотика при приготовлении ферментных смесей можно использовать раствор маннитола (0,45 моль/л), раствор сахарозы (0,5 моль/л) или солевую среду W-5 (табл.2.10).
Обычно для получения большого количества протопластов из каллусного материала используют ферментную смесь, приготовленную на основе среды W-5, а из мезофилла листа-на растворе маннитола (0,45 моль/л) или сахарозы (0,5 моль/л). Для синхронного выделения каллусных и мезофильных протопластов применяют разные концентрации ферментов, а ферментацию проводят при 20-250С в течение 10-16 ч в темноте.
Выделенные протопласты фильтруют через воронку с капроновой сеткой с диаметром пор 60-100 мкм, фильтрат центрифугируют три-четыре минуты при 500-700 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, протопласты ресуспендируют в 10 мл среды W-5 или растворе маннитола (0,45 моль/л) и повторяют процедуру один-два раза. Иногда необходима очистка протопластов с применением сахарозы (0,5 моль/л), что позволяет в процессе центрифугирования удалить из суспензии разрушенные клетки и остатки клеточных стенок, препятствующих проведению процесса слияния.
Индуцированное слияние растительных протопластов проводят обычно по методике «ПЭГ - высокое значение рН - высокое содержание Са2+». Отмытые от ферментного раствора каллусные и мезофильные протопласты смешивают в соотношении 1:1 или 2:1 в конечном объеме суспензии 1-2 мл. «Густую» суспензию протопластов пипеткой наносят на дно чашек Петри диаметром 4 см и оставляют на 10-20 мин для осаждения. Диаметр капли равен примерно 1 см. Через 10-20 мин к смеси осевших на дно чашки Петри протопластов добавляют осторожно сверху или с боков 1-3 капли раствора полиэтиленгликоля (табл. 2.11) и выдерживают 5-25 мин.
Таблица 2.11. Раствор полиэтиленгликоля
| Компоненты | Количество |
| Глюкоза | 2000 мг |
| CaCl2 . 2H2O | 150 мг |
| KH2PO4 | 10 мг |
| ПЭГ м.в. 6000 (можно использовать ПЭГ м.в. от 2000 до 6000) | 50 г |
| Н2О | 100 мл |
Под воздействием раствора ПЭГ происходит слипание и агрегация родительских протопластов, сцепленных с дном чашки Петри. Они меняют сферическую форму и слегка плазмолизируются, одновременно двух-трехслойный осадок протопластов превращается в однослойную «сеточку».
Через 20-25 мин к препарату, обработанному ПЭГ, дважды добавляют буферный раствор (высокое значение рН – высокое содержание Са2+) по 5-6 капель с интервалом 10 мин. В некоторых случаях (в зависимости от конкретного растительного материала) разбавление буферной смесью можно проводить одноразово, добавляя 0,5-1 мл буферной смеси на чашку.
Таблица 2.12. Буферная смесь, рН 10,5
| Компоненты | Количество |
| Натрий-глициновый буфер | 10 мл |
| Глюкоза | 1200 мг |
| ДМСО (диметилсульфоксид) | 2 мл |
| CaCl2 . 2H2O | 266 мг |
| Н2О | до 20 мл |
Примечание. Состав натрий-глицинового буфера: 380 мг глицина растворить в 50 мл Н2О и довести до 100 мл раствором NaOH (0,1 моль/л)
После обработки препарата буферной смесью в течение 30 мин раствор ПЭГ – буфер осторожно отбирают пипеткой, не оголяя слоя протопластов, с интервалом 5-10 мин отмывают тремя порциями питательной среды МО-1 (общий объем 8-10 мл). В дальнейшем смесь гибридных и родительских протопластов культивируют в тонком слое питательной среды МО-1 (1 мл) на рассеянном свету при температуре 250С 3-10 сут.
Таблица 2.13. Состав питательной среды МО-1, рН 5,6-5,8
| Компоненты | Количество | Компоненты | Количество |
| Макро NT | 250 мл | Пролин | 2 мг |
| Микро МС | 1 мл | Гидролизат казеина | 300 мг |
| Fe-хелат | 10 г | Дрожжевой экстракт | 300 мг |
| Сахароза | 10 г | Альбумин яичный | 200 мг |
| Мезоинозитол | 100 мг | Нафтилуксусная кислота | 2 мг |
| Маннитол | 62 г | Индолилуксусная кислота | 1 мг |
| Глюкоза | 10 г | 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота | 1 мг |
| Витамин В1 | 2 мг | 6-бензиламинопурин | 1,5 мг |
| Витамин В6 | 2 мг | Зеатин | 0,1 мг |
| Биотин | 0,5 мг | Вода | До 1 л |
| Никотиновая кислота | 2 мг | | |
Питательную среду МО-1 стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2-0,4 мкм.
2.7.2. МЕХАНИЧЕСКАЯ ИЗОЛЯЦИЯ И КУЛЬТИВИ
РОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ СЛИЯНИЯ
После проведения слияния смесь гибридных и родительских протопластов культивируют на богатых органическими компонентами питательных средах до наступления первых делений в гибридных клетках. Обычно гибридные клетки активно делятся на питательных средах, индуцирующих деление каллусных протопластов одного из родителей, хотя оптимальную среду культивирования почти всегда подбирают эмпирически. За 2-12 ч до начала работ по механическому отбору единичных продуктов слияния культуру протопластов необходимо в 5-10 раз разбавить свежей питательной средой и перенести в чашки Петри диаметром 6 см. Одновременно готовят к работе и чашки Купрака. Для создания необходимой влажности их внешняя камера заполняется раствором маннитола (0,25 моль/л). Номерные ячейки внутренней камеры необходимо заполнить питательной средой (объем 0,5 мкл). Гибридные делящиеся клетки отбирают с помощью полуавтоматической микропипетки на 1 мкл.
При помощи инвертированного микроскопа, находящегося в стерильной камере ламинарного бокса, идентифицируют продукты слияния, претерпевшие два-три деления. Продукты слияния имеют морфологию каллусных клеток, но содержат вокруг ядра и частично в цитоплазме зеленые хлоропласты, происходящие от мезофильных протопластов второго родителя. Отбор клеток проводят при увеличении 100-200, что позволяет быстро подводить кончик наконечника микропипетки в поле зрения к гибридной делящейся клетке. После подводки наконечника к клетке начинают медленно втягивать 1 мкл среды с данной клеткой. В номерную ячейку внутренней камеры чашки Купрака, осторожно выдавливают плавающую клетку с 1мкл среды; при этом микропипетку нужно держать вертикально и не касаться концом наконечника дна ячейки. В чашке Купрака делящиеся гетерокариоциты культивируют 6-8 дней, затем в каждую ячейку необходимо добавить по 1 мкл свежей среды. Через 14-20 дней образовавшиеся гибридные колонии можно поместить в капли (100-200 мкл) свежей питательной среды и через пять-шесть дней пересадить на среду с пониженной концентрацией осмотика по схеме 0,45-0,3-0,2 (моль/л).
Колонию гибридных клеток после семидневного роста на жидкой питательной среде делят на две части. Одну часть переносят на агаризованные питательные среды с цитокининами для индукции органогенеза, а другую часть используют для цитогенетического анализа с целью доказательства гибридности по клеточному ядру.
2.8.ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ
Генетическая трансформация является одним из современных эффективных методов. Этот подход позволяет успешно решать целый ряд задач, приведем главные из них:
1)изучение механизмов регуляции действия генов: клонированный маркерный ген помещают под контроль исследуемого промотора, затем получают трансгенные растения с этой конструкцией и анализируют характер экспрессии маркерного гена;
2)определение функций генов: если ген клонирован, но функция его неизвестна, то с помощью трансформации можно изменить его копийность или уровень экспрессии, в результате функция гена будет выявлена;
3)создание трансформированных форм, обладающих ценными практическими свойствами.
У растений известны два пути естественной транформации: с помощью вирусов или вироидов, а также с помощью Ti- или Ri- плазмид агробактерий. На основе этих систем был осуществлен успешный перенос рекомбинантных ДНК в растительную клетку.
Основные принципы конструирования векторных систем. Понятием «вектор» обозначают рекомбинантную молекулу ДНК (РНК), способную переносить встроенный в нее ген в клетку хозяина. Идеальный вектор должен содержать в себе элементы, обеспечивающие его автономную репликацию в клетке хозяина. Для этого обычно используют репликативные элементы, входящие в состав естественных плазмид соответствующего объекта. К сожалению, у растений такие плазмиды ( не считая митохондриальных и хлоропластных) до сих пор не обнаружены. Поэтому растительные вектора предназначены либо для интеграции в хромосому (что осуществляется в естественных системах трансформации растений), либо для временной трансформации, когда введенная ДНК не реплицируется при делении трансформированной клетки, а потому довольно быстро утрачивается. Любой вектор должен нести генетические маркеры, позволяющие легко обнаружить трансформированные клетки. В качестве таких маркеров обычно используют гены, обуславливающие устойчивость к антибиотикам. Кроме того, в составе вектора должен находиться полилинкер, служащий для встраивания гена. Часто перед полилинкером располагают последовательности, обеспечивающие экспрессию встроенного гена, которого, как правило, предварительно лишают собственного промотора. Наконец, неоходимо, чтобы вектор содержал участки, обеспечивающие его удобное воспроизведение в бактериальных клетках:ori-локус, осуществляющий репликацию вектора в бактерии, а также соответствующий селективный маркер.
Агробактериальная система трансформации. Исследования почвенной бактерии Fqrobacterium tumefaciens привело к открытию естественной векторной системы, переносящей гены бактерии в растительный геном. При нанесении культуры агробактерий на раневую поверхность растения бактерии присоединяются к растительной клеточной стенке. Это присоединение определяется бактериальными генами, локализованными в нуклеоиде. Затем включаются гены, локализованные в vir-районе (virulent area) Ti-плазмиды (tumor inducing). В результате экспрессии этих генов другой участок Ti-плазмиды, Т-ДНК (transfer), переносится в растительную клетку и случайно встраивается в хозяйскую хромосому. В составе ДНК переносятся гены биосинтеза ауксина и цитокинина, в результате трансформированная клетка приобретает опухолевые свойства. Таким образом, при использовании агробактериальных векторов, содержащих бактериальные онкогены, резко ограничена возможность регенерации из трансформированных тканей полноценных растений. По этой причине используются главным образом обезоруженные плазмиды, т.е. плазмиды, лишенные онкогенов.
Последовательности Т-ДНК не важны для процесса ее переноса в растение, за исключением 25-членных повторов на ее концах. Т-ДНК обладает многими характеристиками, которые весьма желательны для универсального растительного вектора. Это широкий круг хозяев, эффективная инфекция и генетическая стабильность. Емкость ее достаточно велика: большие фрагменты чужеродной ДНК (длиной 50 т.п.н. и более) эффективно переносятся и интегрируются таким способом в растительную хромосомную ДНК. Например, успешно проведена трансформация табака Ti-плазмидой, которая содержит в Т-области ген, контролирующий канамицин-устойчивость; трансформированные каллусы характеризовались канамицин-устойчивым фенотипом.
Кроме естественных способов трансформации используют ряд искусственных методов: прямую трансформацию протопластов, электропорацию, электорофорез, трансформацию зародышей, биобаллистику, микроинъекции, трансформацию пыльцы.
Электоропорация. Одна из модификаций метода прямой трансформации протопластов. Клетки подвергают кратковременному (10-100 мкс) воздействию электомагнитного разряда, быстрая поляризация клеточных мембран приводит к их обратимому повреждению (образованию пор), что сопровождается повышением их проницаемости для макромолекул. В это время происходит эффективный перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых электрошоку. Так, с помощью электропорации в протопласты Nicotiana tabakum был перенесен ген САТ (хлорамфеникол ацетил-трансфераза), экспрессия которого наблюдалась в трансформанте. В настоящее время электропорация стала стандартным методом трансформации протопластов. Однако все попытки выполнить электропорацию клеток с клеточной стенкой не дали результата.
Электрофорез. Предполагали, что методом электрофореза можно осуществить перемещение ДНК внутрь клетки под длительным воздействием электрического поля. Однако несмотря на некоторые первоначально обнадеживающие результаты электрофорез не обеспечивает проникновения ДНК через клеточную стенку. Таким образом, электрофорез и электропорацию можно использовать только для трансформации протопластов.
Отметим, что при всех достоинствах метод прямой трансформации протопластов имеет серьезный недостаток: сложность регенерации растений из протопластов.
Трансформация зародышей. Как уже было отмечено, клеточная стенка служит непреодолимым барьером для ДНК. Поэтому при попытках разработать методы прямой трансформации интактных клеток особые надежды возлагали на прямую трансформацию зародышей, клеточные стенки которых очень тонкие. Действительно, инкубация зародыша (в первых экспериментах использовались зародыши злаков) в растворе ДНК, судя по многочисленным данным, приводит к успешной трансформации. Первоначально эти результаты истолковывали как успешный пример переноса ДНК через клеточную стенку. Однако в результате более полных исследований было установлено, что во время отделения зародыша от эндосперма происходят многочисленные повреждения клеточных стенок зародыша, с частичным обнажением мембран. Вероятно, именно через эти обнаженные участки плазмалеммы и происходит перенос ДНК внутрь клеток зародыша.
Повреждение более толстых клеточных стенок можно осуществлять с помощью микролазера. Фокусируя лазер на участке клетки, частично повреждают клеточную стенку и мембрану. При инкубации таких «перфорированных» клеток с ДНК последняя может проникать в цитоплазму.
Биобаллистика. В основе этого метода лежит использование «пушки», стреляющей в растительные клетки микроснарядами-частицами металла с адгезированными на них молекулами ДНК. Движущиеся на большой скорости частицы пробивают клеточную стенку, проникают в клетку, и привносимая ДНК может встраиваться в геном хозяина. При этом растительная клетка не получает значительных повреждений и не теряет своей жизнеспособности. Биоболлистика имеет следующие преимущества перед другими методами:
1)сравнительная легкость в обращении;
2)высокая эффективность (один выстрел приводит к трансформации множества клеток);
3)отсутствие специфичности (может поражаться клетка любого типа любого вида растения).
Мы остановимся на характеристике некоторых из перечисленных методов.
2.8.1. ЗАРАЖЕНИЕ ЛИСТОВЫХ ДИСКОВ ТАБАКА
АГРОБАКТЕРИЕЙ
Материалы и оборудование. Стерильные растения табака, петунии, свежие культуры Agrobacterium tumefaciens (штаммы дикого типа, векторные штаммы). Антибиотики: канамицин, карбенициллин, клафоран или цефотаксим, среды для культивирования агробактерий (табл.2.14).
Таблица 2.14. Среды для культивирования агробактерий, рН 7,0-7,5
| Min A | LB | YEB (YTG) | |||
| Компоненты, г/л | Компоненты, г/л | Компоненты, г/л | |||
| К2НРО4 | 10,5 | Триптон | 10,0 | Гидролизат казеина | 10,0 |
| КН2РО4 | 4,5 | Дрожжевой экстракт | 5,0 | Дрожжевой экстракт | 1,0 |
| (NH4)2SO4 | 1,0 | NaCl | 10,0 | Глюкоза | 10,0 |
| Цитрат натрия | 0,5 | MgSO4 | 0,002 | NaCl | 1,0 |
| MgSO4 | 0,25 | | | MgSO4 . 7H2O | 0,25 |
| | | | | CaCl2 . 2H2O | 0,25 |