Лечебный Фитоцентр «феникс»

Вид материала

Содержание

Постановка теста на селективное связывание
Подбор разведения препаратов
Отчет по изучению иммуномодулирующих свойств препарата Флараксин.
Цель экспериментального изучения
Материалы и методы
РБТЛ) на фитогемагглютинин (ФГА)
Таблица 2. Показатели бласттрансформации лимфоцитов на ФГА
Ig), в частности, классов IgА
ЦИК в крови больных составило: рак желудка (РЖ) -201±16,3 ед:; рак легких (РЛ) - 222±14,9 ед:, рак молочной железы (РМЖ

Подобный материал:

1 ... 8 9 10 11 12 13 14 15 ... 29

Постановка теста на селективное связывание
(патент №22989 А, заяв. 30.05.97 г.)

Забор из вены не менее 10 мл крови.
Получение сыворотки, разделение ее на равные части по числу тестируемых препаратов, одна часть - контроль.
Во все части, кроме контроля, добавляют реагент в соотношении 10:1. Разведение реагента надо подбирать эмпирически.
Смесь сыворотки с реагентом инкубируется 2 часа при t 37С.
После инкубации производится депротеинизация сыворотки.
В депротеинизированной сыворотке определяются свободные небелковые SH группы.

Для спектрофотометрического определения SH групп надо подобрать степень разведения реагентов (цитостатиков, Флараксина или др.).

Подбор разведения препаратов

Сначала берется терапевтическое разведение.
Затем на здоровых донорах производят определение небелковых SH-групп в контрольной пробе и после добавление препарата. Правильно подобранное разведение не должно вызывать прибавления SH-групп по сравнению с контролем. Если этого нет, то терапевтическое разведение надо разводить дольше.

Отчет по изучению иммуномодулирующих свойств препарата Флараксин.

Национальный Медицинский Университет имени А.А. Богомольца

Цель экспериментального изучения

Перспективы широкого использования в онкологической практике с терапевтической целью препарата Флараксин, а также при лечении патологических состояний, сопровождающихся проявлениями вторичного иммунодефицита (воздействие радионуклидов, инфекционных факторов и др.) обусловило необходимость более углубленного изучения иммуномодулирующих свойств Флараксина.

В отчете приведены результаты изучения ряда показателей гуморального и клеточного иммунитета у онкологических больных в процессе применения в лечебных целях препарата Флараксин. Были проведены наблюдения у больных со следующими нозологическими формами: рак легких (РЛ)-10 больных; рак желудка (РЖ)-9; рак молочной железы-(РМЖ)-12; рак сигмовидной кишки и рак прямой кишки (РК)-6; рак органов женской половой сферы (РЖПС)-10.

У всех больных опухолевый процесс был определен как III-IV стадия заболевания. В качестве контроля изучены показатели иммунитета в крови 14 доноров крови (практически здоровые люди в возрасте 18-35 лет).

Материалы и методы

Объектом исследования служила кровь больных, из которых были выделены лимфоциты, а также получена сыворотка. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколлурографии (d=1,076 г/см³) и использовали для дальнейшего определения их количественных и функциональных характеристик. Сыворотку крови хранили при t° (- 4 °С) для дальнейшего определения в ней факторов гуморального иммунитета.

Наблюдаемым больным был проведен курс лечения с использованием препарата Флараксин по разработанной в Противоопухолевом Научно-Лечебном Фитоцентре "ФЕНИКС" схеме: внутривенно проводилось 16 инфузий Флараксина с перерывом 7 дней после 8 инфузий (препарат разводился в 20 мл физиологического раствора из расчета 2 мг Флараксина на 1 кг веса больного). Кровь отбирали до начала проведения лечения и через две недели после 16-й инфузии.

Определение количества иммунокомпетентных клеток в крови осуществляли путем постановки реакции розеткообразования с эритроцитами барина в следующих вариантах: общее количество Т-лимфоцитов (Е-РОК) (Jondal I. et al., 1972) ; количество «активных» Т-лимфоцитов (Е_акт-РОК) (Wybran, Fudenberg, 1973). количество теофилин чувствительных (супрессорных) и теофилин резистентных (хелперных) Т-лимфоцитов (Limanbul еt. al., 1978). Одновременно осуществляли количественное определение субпопуляций иммунокомпетентных клеток с помощью прямой иммунофлюоресцентной реакции с моноклональными антителами фирмы «Becton Dickinson» (США): ОКТ–4 - Т-хелперы/индикаторы; ОКТ-8 – Т-супрессоры/киллеры; ОКТ-11 - общий маркер Т-лимфоцитов и ОКТ-22 - общий маркер В-лимфоцитов. Соответственно определяли иммунорегуляторный индекс - СД₄/СД₈. Результаты исследований приведены в табл.1.

Таблица.1. Содержание иммунокомпетентных клеток в крови пациентов пролечившихся Флараксином.

Группа	E-РOK	E_акт - РOK	E_t4-РOK	E_tr - РOK	E-0	ОКТ-11	ОКТ-4	ОКТ-8	ОКТ-22	CД₄/CД₈
Доноры	60,3±2,1	38,9±22	45,6±1,2	19,1±0,9	23,4±1,8	57,1±2,1	42,9±2,4	24,6±1,9	27,4±1,2	1,8±0,1
Перед лечением
РЛ	38,1±3,4	21,7±3,4	41,0±2,4	13,8±0,6	18,2±1,2	39,6±2,4	33,2±3,1	20,5±1,5	22,5±2,3	1,5±0,7
РЖ	41,4±2,8	18,9±2,1	38,9±1,7	18,3±1,6	21,3±2,7	42,8±3,8	26,6±2,4	21,1±2,8	25,6±3,1	1,2±0,4
РМЖ	38,4±1,9	22,4±1,6	32,4±2,3	15,0±2,3	24,7±2,3	37,4±2,9	22,8±3,5	19,0±3,1	18,1±2,9	1,2±0,2
РК	48,7±4,3	19,8±2,0	28,1±3,6	19,0±1,8	19,0±2,0	45,5±2,7	31,5±2,9	22,7±2,6	23,0±1,6	1,4±0,6
РЖПС	41,4±3,9	18,1±2,5	35,0±2,9	13,2±1,6	18,4±2,9	37,8±2,0	23,5±4,2	17,3±2,0	22,4±0,9	1,3±0,4
После 1-го курса лечения Флараксином
РЛ	43,8±2,8	22,4±2,0	42,1±3,1	16,7±2,7	19,6±1,4	42,8±3,4	37,9±2,1	21,6±1,8	23,8±3,2	1,8±0,6
РЖ	46,7±3,1	24,8±3,1	36,7±2,7	18,9±3,1	20,5±2,3	47,2±2,4	25,7±1,2	19,8±1,4	24,8±2,7	1,2±0,9
РМЖ	42,0±2,5	25,6±2,3	34,6±1,9	17,6±2,0	17,1±1,8	40,2±1,9	21,8±2,8	14,7±2,2	21,9±1,8	1,5±0,7
РК	52,8±3,4	20,4±2,0	27,8±2,9	17,0±3,7	18,1±3,4	43,8±2,9	29,6±3,2	11,9±1,9	22,3±2,3	2,4±1,2
РЖПС	43,7±2,1	28,3±3,0	39,2±3,1	16,8±2,2	19,5±2,3	44,5±1,9	22,8±1,9	11,6±2,7	26,9±1,9	2,0±1,6

Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения:
РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника,
РЖПС - рак органов женской половой сферы.

Анализ представленных в таблице количественных показателей содержания в крови иммунокомпетентных клеток свидетельствует, что у всех исследованных больных имел место выраженный вторичный иммунодефицит. Это проявлялось в снижении содержания Т-лимфоцитов и, в меньшей степени, В-лимфоцитов и их субпопуляциопного состава. Параллельная постановка реакции розеткообразования с учетом чувствительности лимфоцитов к теофиллину и обработка их моноклональными антителами выявила более четкие динамические изменения при применении последней методики. Наиболее выраженное снижение количественных показателей лимфоцитов отмечалось у больных раком легких и раком молочной железы. О наличии иммунодефицита у них свидетельствовали и показатели иммунорегуляторного индекса.

После проведенного курса лечения препаратом Флараксин у всех больных отмечена положительная динамика количественных показателей иммунокомпетентных клеток. Отмечено значительное возрастание количества лимфоцитов - хелперов/индукторов, что нашло свое отражение в повышении иммунорегуляторного индекса.

В группе больных раком кишечника и больных раком органов женской половой сферы иммунорегуляторный индекс превысил этот показатель у доноров. Содержание общей популяции Т-лимфоцитов также статистически достоверно повысилось во всех группах больных. Обращает на себя внимание значительное повышение фракции активных Т-лимфоцитов, что свидетельствует о постепенной нормализации этого важного элемента иммунной системы.

Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали по их митогенному эффекту ( РБТЛ) на фитогемагглютинин (ФГА) («Difco» США) радиоизотопным методом с использованием в качестве метки ЗН- тимидин (Adier et al., 1979) с регистрацией результатов на сцинцилляционном счетчике «Inlertechnique IL-4000» ( Франция) и морфологическим методом в модификации Е.Ф. Чернушенко и Л.С. Когосовой (1978) , позволяющем получить информацию о характере и степени трансформации клеток. Показатели бластрансформации лимфоцитов на ФГА у исследованных лиц представлено в табл.2.

Таблица 2. Показатели бласттрансформации лимфоцитов на ФГА и больных в процессе лечения Флараксином.

Группа	Спонтанное включение ЗН-тимидина, имп./мин	Стимуляция ФГА имп./мин.	Индекс стимуляции	Морфоло - гический учет, %
Доноры	1385±360	92264±7217	67,99	72,14±2,1
Перед лечением
РЛ	984±235	40129±5100	40,78	42,41±4,7
РЖ	843±193	28524±2414	33,83	38,10±4,3
РМЖ	860±211	32705±1138	38,02	41,64±3,9
РК	722±126	22629±1840	31,34	36,72±4,1
РЖПС	81±107	28666±1732	35,34	39,40±2,6
После 1- го курса лечения
РЛ	1012±265	42504±2315	42,05	44,06±4,7
РЖ	890±159	31150±1165	35,64	42,90±4,3
РМЖ	720±190	3528±1632	49,25	47,64±2,8
РК	750±175	27750±1575	37,18	42,90±2,6
РЖПС	790±120	32390±1764	41,29	41,74±5,1

Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.

Результаты изучения митогенных изменений Т-лимфоцитов под влиянием стимуляции фитогемаглютинином свидетельствуют, что изначально пониженные функциональные свойства лимфоцитов, наблюдаемые у больных с различной локализацией новообразований, несколько повысились. Это нашло свое отражение в повышении индекса стимуляции тенденции к повышению процента бласттрансформации лимфоцитов. Однако, их показатели после 1 курса лечения Флараксином не достигают значений у здоровых лиц, что, по-видимому, требует продолжения курса лечения этим препаратом.

Объективным показателем функционирования В-системы лимфоцитов служит уровень синтеза ими иммуноглобулинов ( Ig), в частности, классов IgА, IgМ и IgG. Определение этих показателей проводили в сыворотке крови методом радиальной иммуно-диффузии по Manctnietal. (1965) с использованием моно-специфических анти-сывороток (НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова, Москва). Результаты этих исследований приведены в табл.3

Таблица 3. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови больных, пролечившихся Флараксином.

Группы	Перед лечением			После 1го курса лечения
Группы	Ig A	Ig M	Ig G	Ig A	Ig M	Ig G
Доноры	2,1±0,24	1,61±0,24	15,7±1,7	-	-	-
РЛ	1,98±0,12	1,82±0,17	16,7±2,2	2,10±0,16	1,32±0,61	14,8±1,4
РЖ	1,81±0,18	1,56±0,12	13,4±1,3	1,76±0,32	1,64±0,28	15,1±2,1
РМЖ	2,14±0,16	1,98±0,80	18,1±0,9	1,90±0,21	1,75±0,32	16,4±1,7
РК	2,02±0,14	1,63±0,12	14,4±1,4	1,85±0,30	1,50±0,34	15,3±2,0
РЖПС	1,85±0,11	1,75±0,80	16,7±2,3	1,92±0,26	1,23±0,21	14,8±2,1

Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы,
РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.

Результаты определения иммуноглобулинов сыворотки крови у обследованных больных свидетельствуют, что изменение в их содержании в различных группах были неоднозначными не носили характера определенной закономерности. Так, содержание Ig класса А незначительно отличалось от такового в контрольной группе. После применения препарата Флараксин наблюдалось некоторое IgA снижение, однако, оно не было статистически достоверно. Содержание Ig класса М в случаях рака молочной железы (РМЖ) и рака легких (РЛ) было повышенным, и лишь после 1 курса лечения наметилась тенденция к его снижению. Эта же закономерность прослеживалась и при других локализациях опухоли.

В случаях рака молочной железы (РМЖ) и рака органов женской половой сферы (РЖПС) отмечена тенденция повышения концентрации Ig класса G. После проведенного лечения зарегистрировано снижение содержания Ig класса G до контрольных значений.

Иммунные комплексы (комплекс антиген-антитело) являются важным элементом формирования иммунного ответа. Содержание иммунных комплексов в крови характеризует тяжесть клинического течения болезни, сопровождаемого хроническими воспалительными изменениями и деструктивными процессами. Наблюдения за их динамикой и концентрацией может быть использовано в онкологической практике в диагностике и для прогнозов, а так же для контроля за их эффективностью проводимой терапии.

Определение циркулирующих иммунных комплексов проводили по методу Haskova et at. (1978), используя для их преципитации 3,5% раствор полизтилен-гликоля - м.в. 6000 («Loba Chemie», Австрия) с у четом результатов на микроспектрофотометре «Specol-10» (Германия). Измерения проводили при длине волны 450 nm (ОП450) и выражали результаты в условных единицах экстинкции.

Содержание Циркулирующих Иммунных Комплексов (ЦИК) в крови практически здоровых лиц (доноров) в среднем составляет (М±m) - 49,92±2,85 ед. Концентрация ЦИК в сыворотке обследуемых больных составила: рак желудка (РЖ) - 152±10,4 ед., рак легких (РЛ) - 181,0±8,9 ед., рак молочной железы (РМЖ) - 174,1 ±13,1 ед ; рак кишечника (РК) - 132,05±10,2 ед.; рак органов женской половой сферы (РЖПС) - 139,08±12,1 ед.

После проведения 1 курса лечения препаратом Флараксин (Flaraxin) содержание ЦИК в крови больных составило: рак желудка (РЖ) -201±16,3 ед:; рак легких (РЛ) - 222±14,9 ед:, рак молочной железы (РМЖ) - 189±8,8 ед; рак кишечника (РК) - 156±11,6 ед; рак органов женской половой сферы (РЖПС) - 163±16,5 ед.

Как видно из выше приведенных результатов, во всех наблюдаемых случаях заболеваний с различной локализацией новообразования, имело место значительное повышение содержания ЦИК. Это явление можно объяснить тем фактом, что под влиянием воздействия препарата происходит массивная деструкция опухолевой ткани с дальнейшей резорбцией продуктов распада ретикуло-эндотелиальной системой организма. В результате связывания этих продуктов, имеющих белковую структуру и несущих антигенную информацию, происходит образование соответствующих антител, в свою очередь, образующих дополнительное количество комплексов антиген-антитело (ЦИК).

Пожалуй, наиболее значимыми в изучении состояния иммунной системы у больных злокачественными новообразованиями является определение количественного состава и функциональной активности киллерной (цитотоксической) фракции лимфоцитов крови. Эти лимфоциты являются специализированной популяцией, обладающей цитотоксическим действием к лейкозным, опухолевым и вирус-инфицированным клеткам. В частности, Естественные Киллеры (ЕК), являются «первой линией обороны» против роста опухолевых клеток в организме и осуществляют противоопухолевый надзор, уничтожая появляющиеся в тканях и крови, злокачественно трансформированные клетки. Ослабление активности лимфоцитов-киллеров является одним из определяющих факторов снижения резистентности организма при развитии первичных опухолей. Данные литературы свидетельствуют, что развитие опухолевого процесса сопровождается значительным угнетением киллерного звена иммунологической защиты.

Естественные лимфоциты-киллеры определяли с помощью моноклональных антител NKH-1 («Coulter» США) с использованием прямого иммуно-флюоресцентного метода (А.Л.Пешков и А.И.Полетаева, 1985). Цитотоксическую активность лимфоцитов оценивали в реакциях естественной и антителозависимой цитотоксичности ( С.М.Гордиенко, 1983; Г.Ф.Железнякова и З.У.Гнилевская, 1988). В качестве клеток-мишеней использовали эритроциты кур. Соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней при изучении антителозависимой цитотоксичности составило 25:1, а естественной клеточной цитотоксичности 10:1. Результаты исследований приведены в табл.4.

Таблица 4. Количество естественных лимфоцитов-киллеров ( ЕК, % ) , антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, %) и естественной киллерной цитотоксичности (ЕКЦ, %) в крови больных до и после лечения Флараксином.

Группа	Перед лечением			После лечения
Группа	ЕК %	АЗКЦ %	ЕКЦ %	ЕК %	АЗКЦ %	ЕКЦ %
Доноры	13,15±1,43	22,42±2,59	34,11±3,01	-	-	-
РЛ	9,68±2,14	18,12±4,23	21,64±2,86	10,32±3,30	23,84±3,86	29,32±2,14
РЖ	5,03±1,08	10,70±2,74	19,17±3,72	7,48±2,17	15,38±2,84	23,02±3,07
РМЖ	6,32±1,24	12,32±3,01	15,19±2,64	6,84±3,14	16,43±3,00	20,98±2,06
РК	8,70±1,96	17,14±2,72	17,32±3,12	8,95±2,16	19,08±2,83	23,74±2,23
РЖПС	7,28±2,60	9,08±2,14	14,83±3,74	9,81±3,26	12,72±3,48	24,39±3,09

Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения:
РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника,
РЖПС - рак органов женской половой сферы.

Исходя из данных таблицы, можно заключить, что неоплазматический процесс у всех исследуемых больных сопровождается достоверным снижением как количественных, так и функциональных показателей киллерной системы лимфоцитов. Особенно существенным этот дефект отмечен в группе больных раком желудка и раком молочной железы. Проведение первого курса лечения препаратом Флараксин привело к статистически достоверному повышению активности как антителозависимой, так и естественной киллерной активности лимфоцитов.

Однако к сроку наблюдения показатели активности не достигали нормальных значений (контроля). Исключения составляли показатели антителозависимого клеточного цитолиза, а в группе больных раком легкого, где они даже превысили таковые у доноров. Несколько медленнее восстанавливались показатели естественной киллерной активности.

Выявленное положительное влияние препарата Флараксин в терапии больных с новообразованиями на восстановление киллерной активности, а так же количественные показатели лимфоцитов имеют существенное практическое значение.

Проведение онкологическим больным курсов химиотерапии приводит к значительному угнетению функционирования иммунной системы и, в первую очередь, ее цитотоксических факторов. Учитывая, что значительный удельный вес в противоопухолевой защите организма имеет неспецифический иммунный ответ, обусловленный, в основном, ЕК- активностью, восстановление этой функции положительно коррелирует с эффектом химиотерапии.

Важное значение в формировании противоопухолевой резистентности играет взаимосвязь цитологических факторов с системой интерферона. В современной литературе накоплено много фактов о возможной селективной активности ЕК-системы, в частности, влияния интерферона и его индукторов на их активацию при опухолевом росте. Предполагается, что все агенты, усиливающие ЕК-активность, могут действовать через интерферон, который способен модулировать чувствительность клеток-мишеней и усиливать ЕК-активность у животных и человека (Klark Е. et al., 1989; Hanna Н.,1992 и др.). Многими авторами (Herberman R.B. et al., Ortaldo J.R. ,1991; Kadish A.S. et at., 1981 и др.) показано, что обработка ЕК- клеток интерфероном значительно усиливает конъюгацию ЕК- клеток с различными лейкозными и опухолевыми клетками и способствует лизису ЕК- клеток.

Важную роль в усилении цитолитического действия ЕК-клеток отводят индукторам интерферонной активности (Axberg І. еt at., 1990; Herberman R.B.,1982 и др.). Учитывая наличие у препарата Флараксин интерфероногенных свойств ( см. Отчет НИИ Микробиологии и Вирусологии им.Д.К.Заболотного) можно заключить, что его использование в противоопухолевой терапии подтверждает теорию взаимодействия естественных киллеров и клеток – мишеней, что обосновано результатами, приведенных нами исследований.

Blog