Теоретическое обоснование и практическая реализация технологий гидролизатов молочных белков и специализированных продуктов с их использованием
| Вид материала | Автореферат |
- Научное обоснование и практическая реализация разработки пищевой продукции с использованием, 839.05kb.
- Теоретические и экспериментальные исследования закономерностей формирования сырных, 733.87kb.
- Обоснование технологии производства молока и молочных продуктов в условиях введения, 915.78kb.
- Тесты по теме: «Блюда из молока и молочных продуктов», 27.84kb.
- «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», 301.57kb.
- Технология производства и переработки молока, 7.71kb.
- Омский Государственный Аграрный Университет Факультет технологии молока и молочных, 19.47kb.
- Годовой отчет ОАО «Курганский комбинат молочных продуктов №1» за 2011, 158.41kb.
- Специальность 260303 – «технология молока и молочных продуктов» Специализации, 17.32kb.
- Курс 4 Семестры 7 Всего аудиторных занятий 51 часов, в т ч.: 7 семестр 51 час, из них:, 148.28kb.
Глава 1. Научные и практические предпосылки разработки современных технологий ФГМБ (аналитический обзор). Рассмотрен вопрос о роли белка в питании здорового и больного человека. Эти данные в дальнейшем использованы при разработке функциональной классификации ФГМБ и СП на их основе. Сформулированы медико-биологические требования к белковым компонентам СП и определены основные параметры, определяющие их качество, включая биологическую ценность, содержание отдельных аминокислот, ММР пептидных фракций, остаточную АГ, осмолярность. Представлены данные, свидетельствующие о преимуществах использования пептидных фракций ФГМБ в качестве белковых компонентов различных СП. Рассмотрены общие вопросы получения ферментативных гидролизатов пищевых белков с позиции активности и специфичности применяемых ферментных препаратов, режимов и кратности обработки. Проанализированы данные мировой патентной литературы об основных технологических подходах к получению ФГМБ, методах их мембранной очистки и фракционирования, селективной сорбции фенилаланина, технологии СП на основе ФГМБ и аминокислотных смесей.
Глава 2. Обоснование направлений собственных исследований, их цель и задачи. В главе показано, что в области технологии СП на основе ФГМБ имеется ряд важных нерешенных задач. Недостаточно разработаны подходы к получению ФГМБ на основе сывороточных белков, как наиболее перспективного ввиду его высокой биологической ценности. Необходимо также разработать технологии гидролиза, позволяющие получать ФГМБ как с глубокой, так и со средней степенью гидролиза. Для ФГМБ с глубокой степенью гидролиза критически важным является снижение АГ до уровня не выше 1.10-5 от исходного белка, что практически недостижимо при использовании существующих технологических подходов. Для гидролизатов со средней степенью гидролиза, помимо показателя АГ, необходимо достижение невысокой осмолярности и удовлетворительных вкусовых свойств. Это может быть осуществлено за счет снижения содержания в ФГМБ свободных аминокислот и увеличения доли фракции «средних пептидов».
Особенностью ФГМБ, предназначенных для получения удовлетворяющих современным требованиям продуктов для питания больных ФКУ, является средняя молекулярная масса пептидов, которая должна быть как можно меньшей, чтобы обеспечить высокоэффективную сорбцию фенилаланина. В литературе в настоящее время не освещены технологии получения таких гидролизатов на основе сывороточных белков, а также оптимальные методы селективной сорбции фенилаланина из различных ФГМБ. Поэтому разработка универсальной схемы и частных технологий ФГМБ, а также обобщенной схемы блочно-модульного типа для получения СП является одной из важнейших задач современных технологий.
В заключение главы сформулирована цель и задачи исследований.
Глава 3. Структура исследований, организация эксперимента, объекты и основные методы исследований. Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в 1986-2007 гг. в соответствии с поставленными задачами в ГНУ Всероссийском НИИ детского питании Россельхозакадемии (г. Истра), а также в научно-исследовательском центре ОАО «Нутринвестхолдинг». Общая схема исследований представлена на рис. 1. Весь цикл исследований состоял из нескольких логически взаимосвязанных этапов.
Первый этап работы связан с обобщением материалов отечественных и зарубежных специалистов по теме исследований. На основании анализа информации обоснована необходимость создания СП на основе ФГМБ, сформулирована цель и задачи собственных исследований.
Второй этап посвящен экспериментальному изучению закономерностей получения ФГМБ. Исследовали процесс накопления пептидов различной молекулярной массы в составе ФГМБ в ходе ФГ систем с различным соотношением казеинов и сывороточных белков под действием ферментных препаратов в зависимости от ряда технологических факторов, включая фермент-субстратное соотношение, продолжительность гидролиза, режимы температурной обработки, наличие рН-статирования. В получаемых ФГМБ оценивали изменение ММР, содержание свободных аминокислот, остаточной АГ.
На основании данных об остаточной протеолитической активности в гидролизатах определяли параметры инактивации фермента.
В дальнейших исследованиях изучали особенности очистки и фракционирования ФГМБ, анализировали изменение свойств гидролизатов в процессе мембранной обработки (в т.ч. кратной) с использованием ультрафильтрации (УФ), селективной ультрафильтрации (СУФ), НФ и обратного осмоса (ОО), разрабатывали принципы расчета процессов мембранного фракционирования ФГМБ. В качестве основных контролируемых при получении ФГМБ величин выбраны характеристики мембранных процессов, ММР, остаточная АГ, расчётная биологическая ценность.
| ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЙ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ И СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |||||||||||||
| | | ||||||||||||
| I. Теоретические исследования | |||||||||||||
| | | | | ||||||||||
| | | | |||||||||||
| | Обобщение и анализ результатов отечественных и зарубежных исследований | | - аналитический обзор - обоснование направлений собственных исследований - цель и задачи работы | ||||||||||
| | | ||||||||||||
| | | | |||||||||||
| | II. Экспериментальные исследования | ||||||||||||
| | | | |||||||||||
| | Оптимизация процессов ФГ молочных белков (КМБ и КСБ) | | - параметры процесса - кинетика ФГ - ММР - АГ - аминокислотный состав - режимы инактивации фермента | ||||||||||
| | | ||||||||||||
| | | | | | | ||||||||
| | Изучение характеристик ФГМБ в процессе мембранной обработки | | - селективность мембран - параметры процесса - кратность обработки - состав и свойства гидролизатов - принципы расчета | ||||||||||
| | | ||||||||||||
| | | | | | | ||||||||
| | Исследование закономерностей удаления фенилаланина из ФГМБ с использованием АХр | | - ММР - содержание фенилаланина - закономерности фракционирования - параметры АХр | ||||||||||
| | | ||||||||||||
| | | | | | | ||||||||
| | Разработка параметров технологий ФГМБ | | - ФГ, УФ, СУФ, ОО, АХр - параметры сгущения и сушки - частные технологии ФГМБ - состав и свойства образцов | ||||||||||
| | | | | | | ||||||||
| | Разработка блочно-модульной схемы получения ФГМБ и СП на их основе | | - технологические блоки - принципиальная блочно-модульная технологическая схема - классификация ФГМБ и СП | ||||||||||
| | | | | | | ||||||||
| | III. Практическая реализация результатов исследований | ||||||||||||
| | | | |||||||||||
| | | | | | |||||||||
| | Организация производства | | Техническая документация | | Социальная значимость | ||||||||
Рис. 1. Схема проведения исследований
Исследовали закономерности селективной сорбции фенилаланина из ФГМБ, прошедших мембранную очистку и фракционирование. Оптимизировали процесс АХр.
Обобщенный материал экспериментальных исследований послужил основанием для разработки технологических процессов различных видов ФГМБ и СП на их основе.
Следующая часть исследований связана с разработкой классификаций ФГМБ и продуктов на их основе, обоснованием принципиальной технологической схемы с указанием технологических процессов и контролируемых величин, а также блочно-модульной схемы получения ФГМБ и СП.
Третий, заключительный этап работы, связан с практической реализацией результатов исследований. В соответствии с медико-биологическими требованиями осуществляли адаптацию разработанных технологий к промышленным условиям, разрабатывали техническую документацию, внедряли результаты исследований в промышленности с проведением клинических апробаций новых СП, оформляли патентную документацию.
На разных этапах работы объектами исследований являлись: молоко коровье, предназначенное для производства продуктов детского питания; концентрат молочного белка (КМБ) и КСБ с массовой долей белка не менее 80%, в т.ч. получаемые по импорту и разрешенные органами Госсанэпиднадзора Минздрава России для использования в производстве продуктов детского питания; коммерческие ферментные препараты «Флавоэнзим» из Asp. оrhyzae («Novozyme», Дания) и «Панкреатин» из поджелудочной железы крупного рогатого скота (отечественного или импортного производства); сорбент ХАД-16 («Laboratoire Channy», Франция) для АХр, лабораторные, пилотные и промышленные образцы продукции.
При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследования.
Физико-химические и микробиологические показатели сырья, вспомогательных материалов и готовых продуктов, контроль параметров технологического процесса осуществляли в соответствии с действующей нормативной базой: МУК 4.2.577 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов»; СанПиН 2.3.4.551 «Производство молока и молочных продуктов»; СанПиН 2.3.2.1078 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»; «Инструкция по технохимическому контролю производства сухих молочных продуктов детского питания», утверждённая 30.12.92; «Санитарно-технологические требования к производству продуктов детского и лечебного питания на молочной основе», утверждённые 16.09.80; «Инструкция по технохимическому контролю для предприятий, вырабатывающих молочные продукты для детей различных возрастных групп», утверждённая 25.12.1980.
При оптимизации процессов получения ФГМБ в лабораторных масштабах гидролиз проводили без предварительной термической обработки субстратов в водяном или суховоздушном термостате с перемешиванием, при температуре 37-50ºС. Контроль рН осуществляли с использованием лабораторных рН-метров. рН-статирование осуществляли добавлением 1,0 М раствора гидроокиси натрия или 1,0 М соляной кислоты. По окончании процесса ферментный препарат в составе гидролизата инактивировали нагреванием при 90-95 оС в течение 5-10 мин. Ультрафильтрацию полученных гидролизатов проводили на лабораторной установке «МИНИТАН» («Millipore»,США) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 5 кД. НФ проводили на установке производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия), через мембрану с размером пор около 0,5 кД при рН 6,0-6,5. Полученные гидролизаты лиофильно высушивали на лабораторной сублимационной сушке.
В основу получения гидролизатов молочных белков со сниженным содержанием фенилаланина положен метод АХр с использованием в качестве неподвижной твердой фазы смолы ХАД-16, представляющей собой пористые гранулы химически модифицированного полистирола. В лабораторных масштабах на хроматографическую колонку (2,540 см) с ХАД-16, уравновешенную дистиллированной водой, через перистальтический насос наносили водный раствор ФГМБ с массовой долей сухих веществ от 20 до 45% в объёме от 10 до 25 мл. После этого проводили элюирование дистиллированной водой со скоростью 2,0 мл/мин в течение 100 минут, отбирая хроматографические фракции на коллектор. Колонку далее регенерировали последовательным пропусканием 600 мл 0,2 М гидроокиси натрия, 500 мл 0,1 М соляной кислоты и 1000 мл дистиллированной воды. В отобранных фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм на спектрофотометре и определяли содержание сухих веществ рефрактометрическим методом, а также проводили анализ ММР методом эксклюзионной хроматографии. После этого фракции лиофильно высушивали. В высушенных фракциях определяли содержание фенилаланина методом ВЭЖХ на обращенной фазе.
В процессе перехода к пилотным условиям производства была применена полупромышленная хроматографическая колонка с неподвижной фазой ХАД-16 размером 44×100 см). В качестве основного критерия подобия при переходе к пилотной установке нами было принято время элюирования полного объема колонки, которое составило 100 минут.
При исследовании характеристик ФГМБ и их фракций, полученных методами мембранной фильтрации и препаративной АХр в лабораторных и полупромышленных масштабах, использовали следующие методы.
ММР пептидов оценивали методом эксклюзионной хроматографии. Были использованы две хроматографические колонки с характеристиками пористости, наиболее подходящими для получаемых ФГМБ. В качестве аналитической колонки применяли колонку высокого давления TSK GEL G2000 SWLX (HP, США), 0,8×30см. В качестве элюента использовали 0,05 М калий фосфорнокислый однозамещенный с 0,15 М хлористым натрием и 0,01% азидом натрия или 0,2 М хлористый натрий с добавлением 0,01% азида натрия. Скорость элюирования составляла 0,2 мл/мин, в качестве проточного детектора использовали спектрофотометрический детектор на длину волны 280 нм.
Использовали также колонку среднего давления с неподвижной фазой «Супероза-12» («Фармация», Швеция) 1,650 см. Скорость элюирования составляла 2,0 мл/мин (при использовании тех же элюентов, что и для предыдущей колонки). В качестве детектора использовали проточный ультрафиолетовый детектор с длиной волны 280 нм, которая является наиболее специфической для белков и пептидов. Обе колонки откалиброваны по стандартному набору водорастворимых глобулярных белков производства фирмы «СЕРВА» (Германия) в диапазоне молекулярных масс (и, соответственно, времен удерживания) от свободного до полного объема.
Массовую долю общего азота в препаратах определяли на анализаторе 1130-AUTO-Kjeltek-3, содержание аминного азота определяли колориметрическим методом с реагентом 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой по методике Воробьева с соавторами. Фракционирование азотистых веществ, а также изучение их состава и свойств проводили по известным методикам; массовую долю аминокислот - после гидролиза белков в 6 Н НСl на автоматическом аминокислотном анализаторе «ААА-400». Аминокислотный скор рассчитывали с использованием шкалы ФАО для идеального белка.
Массовую долю фенилаланина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке «Nucleosil 300-5 C18» 5 мкм, 2504,6 мм. Использовали в изократическом режиме жидкостной хроматограф «MERCK HITACHI» (Япония) с ультрафиолетовым детектором UV L-7400 и длиной волны 220 нм.
Определение протеолитической активности проводили спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата гемоглобина по Фармакопейной статье ФСП 42 0308-1449-01.
Остаточную АГ в ФГМБ определяли по методу торможения непрямого твердофазного иммуноферментного теста на полистироле. В основу метода положена конкуренция антигена, растворенного в объеме образца и такого же антигена, иммобилизованного на твёрдой фазе (полистироле) за связывание с ограниченным количеством специфических антител, растворённых в объёме образца. Путем построения графика в координатах десятичный логарифм разведения (ось абсцисс) - ингибирование реакции в % (ось ординат) рассчитывали методом линейной интерполяции концентрацию 50% ингибирования (ID50) для исследуемого (ФГМБ) и стандартного (белок молока, белок молочной сыворотки) образцов. На основании этих данных определяли остаточную АГ исследуемого образца в долях от АГ стандартного образца и кратность снижения антигенных свойств в ходе обработки.
Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми статистическими методами на ЭВМ с использованием пакетов программ EXCEL 2003 и SPSS 9.0 и 11.5 для Windows.
Глава 4. Оптимизация процессов ФГ молочных белков (КМБ и КСБ). Разработка технологии гидролизатов с заданным составом и свойствами сводится, главным образом, к получению препаратов с необходимой степенью гидролиза, которая в свою очередь, зависит от многих факторов. В качестве субстрата использовали системы, содержащие концентрат молочного белка (КМБ) с соотношением «казеин - сывороточные белки» (К/С), равным 80/20 (нативное соотношение казеинов и сывороточных белков, присущее молоку), и концентрат белка молочной сыворотки (КСБ), характеризуемый указанным соотношением равным 3/97 (соотношение, определяемое присутствием, в основном, сывороточных белков со следовыми количествами казеинов). В результате анализа литературных источников и поисковых исследований в лабораторных условиях с целью получения ФГМБ со средней и глубокой степенью гидролиза выбраны ферментные препараты «Панкреатин» и «Флавоэнзим», соответственно. В первой серии экспериментов изучены ММР ФГМБ, свидетельствующие о накоплении в них различных пептидов и аминокислот в условиях обработки высокоактивным промышленным ферментным препаратом «Панкреатин». В табл. 1 представлены результаты гидролиза КМБ «Панкреатином» в зависимости от продолжительности обработки. Обработку проводили ферментом в количестве 2% по массе сухих веществ, температуре 50+1оС и оптимальном для данного ферментного препарата значении рН 7,4-7,6, которое поддерживали путём рН-статирования.
Таблица 1
ММР гидролизатов КМБ при гидролизе «Панкреатином»
через 2, 4 и 6 часов проведения реакции
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % при продолжительности гидролиза, ч | ||
| 2 | 4 | 6 | ||
| 1 | Более 166 | 2,2 | 3,6 | 3,5 |
| 2 | 166-28,2 | 3,2 | 1,3 | 2,2 |
| 3 | 28,2-11,0 | 3,9 | 2,9 | 1,7 |
| 4 | 11,0-4,0 | 21,1 | 19,1 | 19,1 |
| 5 | 4,0-1,4 | 24,1 | 20,5 | 21,6 |
| 6 | Менее 1,4 | 45,5 | 52,6 | 51,9 |
Как следует из представленных данных, ММР пептидов в продукте реакции практически не изменяется после 4 часов гидролиза, т.е. процесс по существу останавливается. Причина этого состоит, по-видимому, в быстрой инактивации ферментов, входящих в состав «Панкреатина», как вследствие процесса автолиза, так и ингибирования короткими пептидами - продуктами реакции. В дальнейших экспериментах использовали продолжительность обработки белковых субстратов «Панкреатином», равную 3 часам.
Таблица 2
ММР гидролизатов КСБ при гидролизе «Панкреатином» через 3 часа реакции
в зависимости от наличия тепловой инактивации ферментного препарата
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % | |
| без инактивации | с тепловой инактивацией | ||
| 1 | Более 166 | 6,5 | 4,4 |
| 2 | 166-28,2 | 3,6 | 1,2 |
| 3 | 28,2-11,0 | 3,6 | 3,0 |
| 4 | 11,0-4,0 | 19,2 | 21,9 |
| 5 | 4,0-1,4 | 14,2 | 15,4 |
| 6 | Менее 1,4 | 52,9 | 54,1 |
Как следует из данных табл. 2, пептидный профиль панкреатинового гидролизата КСБ весьма сходен с таковым для КМБ. Тепловая инактивация фермента по окончании процесса ФГ практически не влияет на распределение молекулярных масс, что свидетельствует об отсутствии в значительных масштабах процессов агрегации и сшивки пептидов, которые могли бы неблагоприятно повлиять на биологическую ценность получаемого ФГМБ
Результаты оптимизации процесса протеолиза по показателю фермент-субстратного соотношения показали, что увеличение концентрации «Панкреатина» выше 1,5% по массе сухих веществ практически не сказывается на глубине гидролиза (табл. 3). В этой связи концентрация «Панкреатина» 1,5-2,0% по сухим веществам является оптимальной при ФГ белков коровьего молока.
Таблица 3
ММР гидролизатов КСБ в зависимости от фермент/субстратного соотношения
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % при фермент/субстратного соотношении, % | ||
| 0,5 | 1,5 | 3,0 | ||
| 1 | Более 166 | 9,9 | 4,5 | 1,9 |
| 2 | 166-28,2 | 12,3 | 3,8 | 2,4 |
| 3 | 28,2-11,0 | 22,7 | 4,6 | 3,3 |
| 4 | 11,0-4,0 | 22,9 | 27,1 | 29,4 |
| 5 | 4,0-1,4 | 8,8 | 20,1 | 20,5 |
| 6 | Менее 1,4 | 23,4 | 39,9 | 42,5 |
Проведение протеолиза белков молока панкреатином вблизи его рН-оптимума (рН 7,4-7,6) требует постоянного рН-статирования раствором щелочи вследствие закисления реакционной смеси высвобождаемыми карбоксильными группами пептидов и аминокислот. При этом в составе гидролизата накапливаются ионы натрия или калия, вносимые с раствором щелочи, что неблагоприятным образом сказывается на его пищевой ценности и органолептических свойствах. В связи с этим, изучена возможность проведения ферментолиза «Панкреатином» без рН-статирования (табл. 4).
Таблица 4
ММР гидролизатов КСБ при гидролизе «Панкреатином», полученные через
4 и 6 часов проведения реакции без подведения рН
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % при продолжительности гидролиза, ч | |
| 4 | 6 | ||
| 1 | Более 166 | 13,2 | 11,0 |
| 2 | 166-28,2 | 2,6 | 1,9 |
| 3 | 28,2-11,0 | 5,7 | 5,6 |
| 4 | 11,0-4,0 | 25,0 | 22,2 |
| 5 | 4,0-1,4 | 12,5 | 14,5 |
| 6 | Менее 1,4 | 41,0 | 44,8 |
Представленные результаты (для субстрата КСБ), свидетельствуют о меньшей глубине гидролиза белка в этих условиях, если судить по выходу пептидов в диапазоне 1,4-4,0 и менее 1,4 кД (в сравнении с табл. 2).
Таким образом, гидролиз «Панкреатином» без рН-статирования может использоваться в тех случаях, когда глубокий гидролиз белка не требуется.
Оптимизация процесса получения ФГМБ под действием панкреатина по показателю температуры позволила установить, что наилучшие результаты достигаются при 50+1оС. При более высоких температурах происходит быстрая инактивация фермента, а при пониженных (37+1оС) резко снижается атакуемость ряда индивидуальных белков в составе КСБ (таких, как -лактоглобулин), и они выявляются на хроматограммах гидролизатов в виде пиков с не измененной молекулярной массой.
При подборе условий гидролиза КСБ и КМБ ферментным препаратом «Флавоэнзим» принимали во внимание, что этот комплекс протеаз, продуцентом которых является низший гриб Asp.orhizae, обладает рН оптимумом активности вблизи рН 6,0, то есть для проведения процесса не требуется рН-статирование с применением щелочи. Кроме того, ферменты, входящие в состав «Флавоэнзима», обладают более высокой, в сравнении с «Панкреатином» устойчивостью к автолизу и термической инактивации. Следствием этого является возможность проведения процесса в течение значительно большего (в сравнении с «Панкреатином») времени, чем достигается существенное увеличение степени расщепления белкового субстрата. Как следует из данных табл. 5, степень гидролиза, достигаемая при 20 часах гидролиза КСБ, оказывается выше, чем при 6 часах обработки. При этом более 70% белкового материала переходит во фракцию в диапазоне молекулярных масс менее 1,4 кД, т.е. представляет собой свободные аминокислоты и олигопептиды.
Таблица 5
Молекулярно-массовое распределение гидролизатов КСБ «Лакпродан 80»
Флавоэнзимом» в количестве 5% по массе сухих веществ
через 6 и 20 часов гидролиза
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % при продолжительности гидролиза, ч | |
| 6 | 20 | ||
| 1 | Более 166 | 3,6 | 3,1 |
| 2 | 166-28,2 | 2,2 | 1,4 |
| 3 | 28,2-11,0 | 5,1 | 1,9 |
| 4 | 11,0-4,0 | 22,7 | 9,4 |
| 5 | 4,0- 1,4 | 15,8 | 13,7 |
| 6 | Менее 1,4 | 50,6 | 70,5 |
Значение рН реакционной смеси, изначально равное 6,6 (что соответствует собственному значению рН белковых субстратов при их восстановлении водой) снижается на 0,5 единицы в течение первого часа гидролиза и далее не меняется в пределах точности измерения на протяжении всего процесса. В результате отсутствия рН-статирования в гидролизате не накапливаются катионы натрия или калия, что облегчает его использование в составе СП, требования к минеральному составу которых являются весьма жесткими, а также делает более эффективным хроматографическое фракционирование гидролизата.
Оптимизация параметра фермент-субстратного соотношения при гидролизе КСБ и КМБ «Флавоэнзимом» показала, что глубина гидролиза растёт вплоть до 5% фермента по массе сухих веществ реакционной смеси (табл. 6). Дальнейшее увеличение вносимого «Флавоэнзима» нецелесообразно, т.к. приводит к избыточному накоплению потенциально аллергенных материалов ферментного препарата в гидролизате, а также к удорожанию процесса.
Таблица 6
Зависимость ММР гидролизатов КМБ при гидролизе «Флавоэнзимом» от
фермент/субстратного соотношения, продолжительность гидролиза
20 часов, температура 50+1ºС
| № | Диапазон молекулярных масс, кД | Относительное распределение, % при фермент/субстратном соотношении | ||
| 0,5% | 2,0% | 5,0% | ||
| 1 | Более 158 | 12,0 | 6,8 | 9,7 |
| 2 | 158-79,4 | 1,5 | 0,7 | 0,7 |
| 3 | 79,4-28,2 | 11,2 | 5,4 | 1,3 |
| 4 | 28,2-11,2 | 8,1 | 3,3 | 1,7 |
| 5 | 11,2-4,5 | 10,4 | 18,0 | 6,0 |
| 6 | 4,5-1,4 | 16,6 | 18,3 | 12,7 |
| 7 | Менее 1,4 | 40,2 | 47,5 | 67,9 |
Отдельно изучена возможность использования двухстадийных схем протеолиза с последовательной обработкой «Панкреатином» и «Флавоэнзимом» или в обратной последовательности без промежуточной инактивации фермента. Результаты (данные не показаны) свидетельствуют о том, что такая обработка позволяет повысить на 10-20% содержание в ФГМБ продуктов глубокого гидролиза белка (молекулярной массой менее 1,4 кД) и одновременно снизить количество высокомолекулярных белковых фракций. Тем не менее, их полная элиминация при этом всё равно не достигается.
В исследуемых препаратах ФГМБ в процессе ФГ «Панкреатином» определяли содержание свободных аминокислот. Результаты исследований приведены в табл. 7.
Как показал анализ представленных экспериментальных данных, накопление свободных аминокислот происходило пропорционально продолжительности ФГ. Выявлено, что белки в составе КСБ требуют большего времени для ФГ, что связано, вероятно, с меньшей атакуемостью ферментами ряда глобулярных сывороточных белков (-лактоглобулин, сывороточный альбумин) в сравнении с казеинами, доминирующими в составе КМБ. Вместе с тем, способность пептидов - продуктов гидролиза казеина ингибировать ферментативную реакцию приводит к тому, что процесс протеолиза сывороточных белков оказывается, судя по накоплению аминокислот, более растянутым во времени.
В процессе лабораторных исследований на основании анализа остаточной протеолитической активности ферментов установлены оптимальные режимы инактивации: температура 93±2оС с выдержкой 5±0,2 мин.
Таблица 7
Накопление свободных аминокислот в процессе ФГ молочных белков при
температуре 50+1оС, рН 7,5+0,1
| Аминокислоты, мкмоль/л | Белковые субстраты | |||||||
| КМБ | КСБ | |||||||
| продолжительность ФГ, ч | ||||||||
| 0,5 | 1,5 | 3,0 | 5,0 | 0,5 | 1,5 | 3,0 | 5,0 | |
| Триптофан | 917 | 1000 | 2100 | 2169 | 350 | 400 | 605 | 1750 |
| Фенилаланин | 1442 | 2017 | 4033 | 4096 | 244 | 689 | 1333 | 2689 |
| Лейцин | 1847 | 1947 | 3447 | 5516 | 1200 | 1856 | 2218 | 3622 |
| Изолейцин | 692 | 731 | 1077 | 1201 | 686 | 971 | 1743 | 2657 |
| Треонин | - | 433 | 556 | 603 | - | 500 | 1200 | 1575 |
| Метионин | 436 | 564 | 1107 | 1176 | 311 | 667 | 800 | 1489 |
| Лизин | 950 | 1168 | 2515 | 2615 | 920 | 1218 | 2619 | 3220 |
| Валин | 500 | 730 | 1181 | 1270 | 1233 | 1600 | 2367 | 3567 |
| Гистидин | - | 17 | 69 | 75 | - | - | - | - |
| Аргинин | - | 17 | 69 | 75 | - | - | - | |
| Аланин | 256 | 319 | 531 | 608 | 967 | 1133 | 1233 | 2267 |
| Серин | - | 209 | 280 | 316 | - | 216 | 350 | 418 |
| Глутаминовая кислота | 1250 | 2333 | 2600 | 2671 | 429 | 857 | 1025 | 1243 |
| Глицин | 69 | 100 | 115 | 173 | 19 | 114 | 200 | 343 |
| Тирозин | 688 | 1121 | 2421 | 2516 | 600 | 980 | 1890 | 3192 |
Таким образом, исследование в лабораторных масштабах процессов получения ФГМБ в результате гидролиза концентратов молочного белка с разным соотношением казеин/сывороточные белки промышленными ферментными препаратами позволило определить оптимальные условия проведения процесса. В случае использования «Панкреатина» оптимальным является концентрация фермента 2% по массе, температура 50±1оС, продолжительность реакции 3 часа, рН оптимум 7,5 (с рН-статированием щелочью или без него). Применение «Флавоэнзима» наиболее эффективно при содержании фермента 5% по массе сухих веществ, температуре 50±1оС, продолжительности реакции до 20 часов, рН оптимуме 6,0 (без рН-статирования). Подобранные условия действия ферментных препаратов использованы далее при получении ФГМБ в промышленных масштабах.
Итогом исследований в данном разделе явилась оптимизация технологических режимов ФГ для получения ФГМБ на основе КМБ и КСБ со средней и высокой степенью гидролиза. Основные параметры этих процессов и критически важные характеристики получающихся ФГМБ приведены в табл. 8.
Анализ критически важных характеристик ФГМБ, получающихся при действии «Панкреатина» и «Флавоэнзима» на молочные белки, показал, что они близки для КСБ и КМБ. Однако, с учётом существенно большей биологи-
Таблица 8
Технологические характеристики процесса ФГ
| Параметры процесса и характеристики ФГМБ | КСБ+ «Панкреатин» | КМБ+ «Панкреатин» | КСБ+ «Флавоэнзим» | КМБ+ «Флавоэнзим» |
| Массовая доля сухих веществ в растворе, % | 5 | 5 | 3 | 3 |
| Количество фермента от массы субстрата, % | 2 | 2 | 5 | 5 |
| Температура процесса оС | 50±1 | |||
| рН процесса | 7,4-7,6* | 7,4-7,6* | 5,8-6,0 | 5,8-6,0 |
| Продолжительность процесса, ч | 3 | 3 | 20 | 20 |
| Температура инактивации фермента, оС | 93±2 | |||
| Продолжительность инактивации, мин | 5+0,2 | |||
| Мср,** кД | 4,5 | 3,1 | 1,8 | 1,4 |
| АГ | 510-3 | 110-3 | 1,510-3 | 510-4 |
Примечание. *Возможно использование рН-статирования раствором щелочи. **Мср- средняя молекулярная масса пептидов
ческой ценности КСБ в сравнении с КМБ, а также того обстоятельства, что ФГМБ на основе концентратов сывороточных белков имеют в целом гораздо менее выраженную горечь в сравнении с гидролизатами КМБ и казеина. В этой связи выбор КСБ в качестве основного объекта дальнейших исследований представляется предпочтительным.