Geum.ru

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков 03. 00. 04-Биохимия

Вид материалаАвтореферат

Содержание


Рис. 17. Схематическое изображение взаимодействия на неактивную апоформу с разными формами ГАФД и их влияния на активность ферме
Подобный материал:
1   2   3   4

Рис. 17. Схематическое изображение взаимодействия на неактивную апоформу с разными формами ГАФД и их влияния на активность фермента.

I - связывание антител неактивную апоформу с иммобилизованной на BrCN-активированной сефарозе неактивной ГАФД, сшитой глутаровым альдегидом. II – связывание антител типа 1 с нативной апоформой ГАФД, вызывающее инактивацию только одной субъединицы. III - связывание антител типа 1 с нативной холоформой ГАФД, вызывающее инактивацию нескольких субъединиц ГАФД. Символы разной формы обозначают различные конформационные состояния ГАФД.


Предлагаемая нами интерпретация полностью объясняет экспериментальные данные о влиянии антител на неактивную апоформу на активность апоформы ГАФД. При связывании одной молекулы антитела с одной из субъединиц тетрамера апоГАФД происходит постепенная инактивация этой субъединицы без изменения активности остальных (падение активности на 25%) (Рис. 17, II). Иная ситуация наблюдается при связывании тех же антител с холоГАФД. Несмотря на одинаковую стехиометрию образующихся в обоих случаях комплексов (одна молекула антитела на тетрамер ГАФД), степень инактивации холоГАФД значительно выше – до 80%. Следовательно, инактивации подвергается не только связанная с антителами субъединица, но и соседние, которые не контактирует непосредственно с антителом. Таким образом, в случае холофермента антитело изменяет конформацию одной субъединицы, а затем конформационные изменения распространяется по межсубъединичным контактам, приводя к инактивации соседних мономеров (Рис. 15, III). Особенности воздействия антител на апо- и холоГАФД, очевидно, обусловлены разной прочностью межсубъединичных взаимодействий в этих формах – хорошо известно, что междимерные и межмономерные контакты в холоформах ГАФД из различных источников значительно прочнее, чем в апоформах. Следует отметить, что изучение механизмов формирования "неправильной" конформации одного белка при его взаимодействии с измененным партнером приобретает особое значение в связи с появлением данных о том, что сходные процессы лежат в основе образования инфекционных прионов (Sparrer, H.E. et al. 2000).

ВЫВОДЫ.
  1. Получены экспериментальные доказательства существования разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе на стадии гликолитической оксидоредукции. Разобщение стимулируется перекисью водорода, окисляющей сульфгидрильные группы активного центра глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и индуцирующей у фермента новую ацилфосфатазную активность. Появление у глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ацилфосфатазной активности приводит к расщеплению 1,3-дифосфоглицерата и вызывает ускорение гликолиза при недостатке или отсутствии АDP. Разобщение окисления и фосфорилирования в гликолизе может быть также индуцировано добавлением в систему нефосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Индуцированное окислителями ускорение гликолиза, сопровождающееся уменьшением выхода АТР, является новым важным элементом регуляции энергетического обмена при функционировании клеток в условиях окислительного стресса.
  2. Предложена и экспериментально доказана гипотеза, согласно которой способность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы связываться с нуклеиновыми кислотами (РНК и ДНК) регулируется окислением сульфгидрильной группы 149 цистеинового остатка активного центра фермента. При окислении этой сульфгидрильной группы уменьшается сродство фермента к кофактору NAD и образующийся апофермент эффективно связывается с РНК и ДНК.
  3. С целью выяснения роли глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в индукции апоптоза методом иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием моноклональных антител против ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы изучено изменение внутриклеточной локализации этих форм при индукции апоптоза. Было показано, что в клетках HeLa ненативные формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы сосредоточены в основном в ядрах, а также колокализованы с актиновыми филаментами. При индукции апоптоза в клетках HeLa под действием фактора некроза опухолей или перекисью водорода ненативные формы дегидрогеназы выходят из ядра и равномерно распределяются в цитоплазме. Установлено, что перемещение ненативных форм из ядра в цитоплазму может служить индикатором возникновения апоптоза на ранних стадиях.
  4. Установлено, что полипептидные цепи, неспособные свернуться в нативную конформацию (химически модифицированные или мутантные), прочно связываются с шаперонином GroEL, блокируя тем самым шаперонин-зависимое сворачивание белков. На основании этих результатов высказана гипотеза о том, что блокирование шаперонов «неправильно» свернутыми белками, образующимися в результате химической модификации и окислительного стресса, может стимулировать агрегацию белков при различных нейродегенеративных заболеваниях.
  5. Разработан новый метод получения поликлональных антител к различным ненативным формам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, основанный на иммунизации животных нативным антигеном и последующей иммуноаффинной хроматографии на разных иммобилизованных формах белка.
  6. Показано, что антитела, специфичные к денатурированной форме глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, блокируют сворачивание фермента и могут быть использованы для изучения процессов его денатурации и ренатурации.
  7. Показано, что антитела, специфичные к неактивным тетрамерам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, обладают способностью связываться с нативной дегидрогеназой и вызывать развивающиеся во времени дестабилизацию и инактивацию фермента. Инактивирующее воздействие антител в апоферменте распространяется только на одну субъединицу, непосредственно вовлеченную в связывание с антителом, а в холоферменте передается через субъединичные контакты, приводя практически к полной потере ферментативной активности. Обнаруженный механизм инактивирующего воздействия на белки антител, специфичных к ГАФД в неактивной конформации, создает предпосылки для получения принципиально нового типа антител, вызывающих конформационные изменения структуры белков-антигенов.

Список работ, опубликованных по теме

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК РФ:
  1. Плетень А.П., Учитель И.А., Мазо В.К., Никуличева С.И., Волкова Л.И., Шатерников В.А., Выделение ренина из почек человека//Вопросы медицинской химии.-1979.-№4.-С.441-444.
  2. Исаева И.В., Ковалева С.В., Патрики Е.В., Сеничева Н.А., Плетень А.П., Прохоров Б.С., Плохой В.И. Физико-химические свойства и антигепариновая активность протаминов лососевых и осетровых рыб//Химико-фармацевтический журнал.-1989.- № 6.- С.686-691.
  3. Даньшина П.В., Шмальгаузен Е.В., Арутюнов Д.Ю., Плетень А.П., Муронец В.И., Ускорение гликолиза нефосфорилирующей и окисленной фосфорилирующей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназами// Биохимия.-2003.- Т.68, № 5.-С.725-733.
  4. Arutyunova E.I., Danshina P.V., Domnina L.V., Pleten' A.P., Muronetz V.I., Oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enhances its binding to nucleic acids//Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2003.- Vol.307, N3.-P.547-552.
  5. Schmalhausen E.V., Pleten A.P., Muronetz V.I. "Ascorbate-induced oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase"//Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2003.-Vol.308, N3.-Р.492-496.
  1. Arutyunova E.I., Arutyunov D.Y., Pleten A.P., Nagradova N.K., Muronetz V.I., Antibodies specific to modified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase induce inactivation of the native enzyme and change its conformation//Biochim. Biophys. Acta.-2004.-Vol.1700, N1.-Р.35-41.
  2. Арутюнова Е.И., Плетень А.П., Наградова Н.К., Муронец В.И., Антитела к неактивным конформациям глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы инактивируют апо- и холоформу фермента//Биохимия.- 2006.-т.71.-№6.-С.847–855.
  3. Плетень А.П., О возможном влиянии алиментарных факторов на механизм развития нейродегенеративных заболеваний – болезни Альцгеймера и губчатой энцефалопатии у людей//Вопросы питания.-2007.-т.76.-№2.-С.39-44.
  4. Плетень А.П., «Получение разных типов антител после одновременной иммунизации животных двумя антигенами»//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2007.-т.143.-№6.-С.718-720.

Статьи, опубликованные в других изданиях:
  1. Муронец В.И., Плетень А.П., Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В. Изменение структуры и термодинамических параметров шаперонина GroEL при его взаимодействии с ненативными формами белка//Известия национальной академии наук Беларуси, Серия химических наук. 2004, №2.-C.81
  2. В.И. Муронец, А.П.Плетень. Нобелевская премия получена – загадки остались//Природа.- 2005.-№4.-С.44-47.
  3. Muronetz V.I., Pleten A.P., Schmalhausen E.V., Polyakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., Saso L.,. Amiloidoses and oxidative stress. International alumni seminar on «Biotechnology and Health»//Armenia.-Erevan,-2005.-Р.55-61.
  4. Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В., Шалова И.Н., Плетень А.П., Цирюльников К., Эртль Т., Муронец В.И., Стимулирование агрегации белков нефункционирующим шаперонином GroEL//Биомедицинская химия.- 2006.-т.52.-№5.-С.518-524.
  5. Муронец В.И., Плетень А.П.. Нобелевская премия получена – загадки остались. История открытия инфекционных прионов.//В сб. научно-популярных статей РФФИ под ред. В.И.Конова «Российская наука: мечта светла».- М.: Октопус – природа, 2006.- С.239-245.
  6. Muronetz V.I., Pleten’ A.P., Schmalhausen E.V., Asryants R.A., Naletova I.N., Shalova I.N., Saso L., Oxidized proteins block chaperones irreversibly (Role in the induction of amyloidoses)//Neurodegenerative Diseases.-2007.-4 (suppl. 1).-Р. 62.
  7. Плетень А.П., Устойчивость к протеиназам различных типов амилоидных структур, формируемых из пептидов β-амилоида1-42//Известия национальной академии наук Беларуси, серия медицинских наук.-2008.-т.1.-С.43-47.
  8. V.Muronetz, A.Pleten, E.Schmalhausen, I. Naletova, T.Haertle, Pathogenic protein nanostructures while neurodegenerative disorders: identification and new approaches for their destraction//Сб. материалов международной конференции «Биотехнология и здоровье-2» и семинара членов общества DAAD Армении.- Ереван, 2008.- С.76-82.

Материалы научных конференций
  1. Yasykova M.Y., Arutyunov D.Y., Danshina P.V., Pleten A.P., Schmalhausen E.V., Muronetz V.I. Role of phosphorylating and non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in an uncoupling of the process of oxidation and phosphorylation in glycolysis//Abstracts of the International conference "BIOCATALYSIS-2002.-fundamentals and applications".-Moscow.-2002.-Р.148-149.
  2. Muronetz V.I., Polyakova O.V., Pleten' A.P., Roitel O., Branlant G.
    Misfolded forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
    interact with GroEL and inhibit chaperonin-assisted folding// Abst. International Conference «Biocatalisis-2002. Fundamentals and applications».-Moscow.-2002.-Р.25.



  1. Арутюнов Д.Ю., Шмальгаузен Е.В., Даныпина П.В., Языкова М. Ю., Плетень А.П., Муронец В.И. Роль глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназ в регуляции гликолиза//Труды Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики на рубеже нового столетия" и Международного симпозиума "Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина//Москва.- 2002.-С.21-22.
  2. Арутюнова Е.И., Полякова О.В., Плетень А.П., Муронец В.И.
    Получение и разделение антител при одновременной иммунизации
    двумя антигенами//Труды Всероссийской конференции "Проблемы
    медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной
    диагностики на рубеже нового столетия" и Международного
    симпозиума "Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина"//Москва.-2002.-С.22-23.
  3. Плетень А.П., Шмальгаузен Е.В., Муронец В.И. Ферментативная система для тестирования антиоксидантов//Труды Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии. Современные технологии лабораторной диагностики на рубеже нового столетия" и Международного симпозиума "Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина"//Москва.-2002.-С.172.
  4. Муронец В.И., Шмальгаузен Е.В., Даныпина П.В., Арутюнов Д.Ю., Плетень А.П. Индукция разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе окислителями//Тезисы научных докладов III съезда Биохимического общества РАН. Санкт-Петербург.- 2002.-С.95-96.
  5. Плетень А.П., Арутюнова Е.И., Домнина Л.В., Муронец В.И. Изменение внутриклеточной локализации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при перекисном и TNF-индуцированном апоптозе//Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная игнализация"//2003.-Пущино.-РАН.-С.108-109.
  6. Муронец В.И., Шмальгаузен Е.В., Арутюнова Е.И., Плетень А.П. Перекисные соединения индуцируют разобщение окисления и
    фосфорилирования в гликолизе на стадии глицеральдегид-3-
    фосфатдегидрогеназной реакции//Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация".-2003.-Пущино.-РАН.-С.260-261.
  7. Arutyunova E.I., Pleten' A.P., Muronetz V.I. The influence of two types of polyclonal antibodies on the folding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Аbstract Book//Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics.-2003.-Vol.1 (B-2).-P.142.
  8. Naletova I.N., Pleten' A.P., Muronetz V.I. The influence of bacterial chaperonin GroEL on the folding of homologous olygomeric proteins. Аbstract Book//Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics.-2003.-Vol.1 (M-67).-P.108.
  9. I.N. Naletova, I.N. Shalova, L.Saso, E.V. Schmalhausen, V.I. Muronetz, A.P. Pleten'. The role of oxidation of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase in the induction of apoptosis and in formation of amiloid structures//Тезисы юбилейной конференции посвященной 70-летию В.П.Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке»//Москва.-МГУ.- 2005. с. 21-23.
  10. Muronetz V.I., Polyakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Pleten A.P., Saso L., Izumrudov V.A., Schmalhausen E.V., Mechanisms of protein denaturation and design of new Inhibitors of protein aggregation for the treatment of condensation diseases. Abstracts of international conference «Fundamentals and Application» dedicated to 250th anniversary of Moscow State University. neurodegenerative diseases.//Conference Proceedings. International Conference. Biotechnology and Medicine//Moscow-2006.-P.194-195
  11. Муронец В.И., Плетень А.П., Шмальгаузен Е.В., Асриянц Р.А., Шалова И.Н., Налетова И.Н., Сасо Л., Эртль Т. Окислительный стресс и амилоидозы.//Тезисы докладов II Международной конференции Химия, Структура и Функция.-Минск.-2006.- C.99.
  12. Плетень А.П. Механизм действия кверцетина при профилактике болезни Альцгеймера//Сборник материалов XIV российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва,-2007.-C.507-508.
  13. Плетень А.П. Шапероны и формирование устойчивых к протеазам амилоидных структур//Сборник материалов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов».-Москва.-2007.-C.17.
  14. Плетень А.П. Устойчивость к протеиназам различных типов амилоидных структур, формируемых из пептидов бета-амилоида 1-42// Международная научная конференция Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки//-Беларусь.-Минск.-2007.-C.26-27.
  15. Плетень А.П., Арутюнова Е.И., Получение антител, индуцирующих переход ферментов в неактивное конформационное состояние//IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск.-2008.- C.440.
  16. Муронец В.И., Шмальгаузен Е.В., Эртль Т., Плетень А.П. О возможном влиянии пищевых добавок и продуктов питания на развитие нейродегенеративных заболеваний//Сборник материалов Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология. Проблемы и перспективы», Светлогорск.- 2008.- C.103 .