Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков 03. 00. 04-Биохимия

Вид материала

Автореферат

Содержание Формами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. Рис.9. Связывание растворимого GroEL c иммобилизованной ГАФД B.st.. Мы трансформировали клетки Е. coli Рис. 10. Связывание растворимого GroEL с иммобилизованным димером Y283V. GroEL- GroEL Р ис.11. Влияние OR-димеров ГАФД Рис. 12. Влияние ГАФД Рис. 13. Термоагрегация ГАФД и ренина в присутствии синетического поликатиона и протаминов. 5. Получение антител, инактивирующих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Рис. 15 Кривые избыточного теплопоглощения апо- (1) и холоГАФД (2)

Подобный материал:

• Темы рефератов по витаминам и гормонам для студентов 2 курса факультета всэ витамины,, 10.06kb.
• Метаболизм белков у растущих бычков и свиней и факторы его регуляции 03. 00. 04 биохимия, 703.33kb.
• Задачи: Проверить и углубить знания в биосинтезе белков, фотосинтезе и этапах энергетического, 32.48kb.
• Рабочая программа дисциплины «биология клетки» (молекулярная биология) Код дисциплины, 225.32kb.
• План лекций для студентов 3-го курса факультета, 31.63kb.
• Тема строение белков и ферментативный катализ вопросы лекции, 137.02kb.
• Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых, 203.51kb.
• Роль β-адренорецепторов в регуляции водно-солевого обмена у белых крыс, 748.01kb.
• Никитина любовь Сергеевна механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное, 322.15kb.
• «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» Общая трудоемкость изучения дисциплины, 11.18kb.

Что же происходит на начальном этапе после индукции апоптоза, когда исчезает ярко окрашенное ядро и окрашивание равномерно распределяется по всей клетке? Мы предположили, что возможны два пути развития событий – ненативная ГАФД просто выходит из ядра после индукции апоптоза, или она замещается транслоцирующейся в ядро нативной ГАФД, которую антитела 6С5 не окрашивают, поэтому мы больше не видим яркой окраски. Проведение аналогичных экспериментов на клетках с экспрессированным белком Bcl-2, препятствующим развитию апоптоза и транслокация ГАФД в ядро показало, что Bcl-2 не предотвращает перераспределение ненативной ГАФД. Вероятно, перераспределение ненативной ГАФД и транслокация цитоплазматического фермента в ядро при апоптозе – процессы независимые друг от друга и первый процесс нельзя объяснить простым вытеснением ненативной ГАФД из ядра пришедшим из цитоплазмы ферментом. Мы полагаем, что выход ненативной ГАФД из ядра может быть маркером самых ранних этапов развития апоптоза, предшествующим процессу ядерной транслокации цитоплазматической ГАФД.

Мы также изучали распределение в клетке ненативной ГАФД при апоптозе, вызванном действием другого агента – перекиси водорода. Было показано, что через 1 час и 15 минут ядро все еще видно, но оно становится менее четким. А через 3 часа окраска равномерно распределяется по всей цитоплазме. Четких границ ядра больше не видно. Через 20 часов мы наблюдали картину, аналогичную последним стадиям развития апоптоза при индукции TNF. Таким образом, существенных отличий в поведении в клетке ненативной формы ГАФД при перекисном апоптозе от TNF-индуцированного не наблюдается. Кроме того, мы исследовали поведение ГАФД, связанной с актином при перекисном апоптозе с помощью конфокальной микроскопии. После 15 минут и 1 часа 15 минут существенных изменений по сравнению с контрольными клетками обнаружено не было – ГАФД была колокализована с актином. Однако после 3 часов инкубации ненативная ГАФД диссоциировала из комплекса с актином. Это можно было проследить по изменению цвета комплекса – при колокализации фермента с актином он окрашивается в оранжевый цвет, а при диссоциации наблюдается отдельно свечение ГАФД, а отдельно – актина.

Наши исследования показали, что, при нормальных условиях с актином колокализована ненативная ГАФД, это может быть модифицированный фермент, а также димерная или мономерная форма. При апоптозе первое время колокализация ненативной ГАФД с актином сохраняется, однако при дальнейшем развитии процесса, происходит диссоциация комплекса ненативная ГАФД – актин. Можно предположить, что, возможно, в норме в клетке с актином образует комплекс ненативная форма фермента, при апоптозе же происходит вытеснение этой формы нативным ферментом.


4. БЛОКИРОВАНИЕ ШАПЕРОНИНА GroEL С НЕНАТИВНЫМИ

ФОРМАМИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ.

Для проверки гипотезы о возможности необратимого ингибирования шаперонинов модифицированными или мутантными полипептидными цепями, в принципе неспособными сворачиваться в нативную конформацию, мы использовали бактериальный шаперонин GroEL и различные ненативные формы ГАФД. На первом этапе нашей работы мы исследовали взаимодействие шаперонина с модифицированной дитионитробензоатом ГАФД из мышц кролика (ГАФД_ДТНБ). Мы предположили, что ковалентная химическая модификация белка может инициировать конформационные изменения, результатом которых будет образование формы белка, способной взаимодействовать с шаперонином. Так же мы предположили, что из-за необратимости ковалентной модификации, подобная форма белка будет неспособна в принципе сформировать нативную структуру. Было показано, что после модификации 16 сульфгидрильных групп происходит диссоциация фермента на субъединицы, а также изменение его термодинамических параметров. Однако, судя по данным кругового дихроизма вторичная структура ГАФД не нарушается. Параметры связывания GroEL с модифицированной ДТНБ ГАФД определяли, используя иммобилизованные на сефарозе модифицированные мономеры фермента. Было показано, что GroEL эффективно связывается только с иммобилизованной модифицированной ГАФД (рис. 9, 3), но практически не взаимодействует с иммобилизованной тетрамерной ГАФД (дор. 2) и контрольной Сефарозой (дор. 1).




Рис.9. Связывание растворимого GroEL c иммобилизованной ГАФД_ДТНБ.

Растворимый GroEL инкубировали с контрольной сефарозой (1), иммобилизованными тетрамерами ГАФД (2) или с иммобилизованной ГАФД_ДТНБ(3), затем отмывали сефарозу от несвязавшегося белка и анализировали пробы с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. 4 - белки-маркеры.

Следует отметить, что при инкубации комплекса GroEL-ГАФД_ДТНБ в присутствии Mg-ATP не наблюдалось его диссоциации, которая характерна для комплексов шаперонина с полипептидными цепями, способными сворачиваться в нативную конформацию. При титровании иммобилизованного модифицированного фермента растворимым шаперонином были определены параметры связывания этих белков. Кд комплекса GroEL-ГАФД_ДТНБ составила 0,4 мкМ при стехиометрии 0,83 молекулы GroEL на мономер ГАФД.

Таким же образом было исследовано взаимодействие GroEL с мутантрыми димерами термостабильной ГАФД  B.st.. Мы трансформировали клетки Е. coli плазмидами, содержащими гены ГАФД с мутациями в области междимерных контактов (по Р- и R-оси). Были выделены О-Р-димеры (Y46G/S48G и Y46G/R52G) и O-R-димеры (Y283V и Y283V/W84F). При изучении взаимодействия шаперонина с мутантными димерами Y283V и Y283V/W84F использовали иммобилизованный за две субъединицы GroEL. Kд комплекса GroEL/O-R-димеры составила 0,9-0,8 мкМ при стехиометрии 1 димер на молекулу шаперонина. Связывание GroEL с O-R-димерами было подтверждено также анализом препаратов сефарозы методом эдектрофореза в денатурирующих условиях. Как и в случае с модифицированной ГАФД образовавшийся комплекс не распадался после инкубации с Mg-ATP. Взаимодействие GroEL и O-R-димеров наблюдалось и в системе, когда ковалентно связанным с носителем был мутантный димер ГАФД (рис. 10). Таким образом, образование комплекса между GroEL и O-R-димерами мы наблюдаем при иммобилизации любого из партнеров реакции. В аналогичных экспериментах с O-P-димерами не было обнаружено их связывания с шаперонином.

Взаимодействие GroEL с O-R-димерами в растворе было доказано методом нативного электрофореза с последующим иммуноблоттингом. Присутствие обоих белков в комплексе шаперонина с димерами было установлено с помощью специфических антител к субъединицам GroEL и ГАФД.

Дополнительные доказательства образования комплекса GroEL/O-R- димер в растворе были получены при помощи метода иммунопреципитации.


Рис. 10. Связывание растворимого GroEL с иммобилизованным димером Y283V.

1 – белки-маркеры; 2 – инкубация GroEL с контрольной сефарозой; 3 - инкубация с иммобилизованным димером Y283V.

Таким образом, мы доказали образование стабильных комплексов GroEL-ГАФД_ДТНБ и GroEL-O-R-димеры. Наиболее интересным является наблюдение об отсутствии диссоциации данных комплексов в присутствии Mg-ATP Этот факт указывает на возможность необратимого блокирования шаперонов полипептидными цепями, неспособными свернуться в нативную конформацию.

Влияние модифицированной ГАФД_ДТНБ и мутантных O-R-димеров на GroEL-зависимый рефолдинг денатурированной термостабильной ГАФД B.st.

Известно, что ни один цикл связывания и освобождения полипептида из комплекса с GroEL не может произойти в отсутствие Mg-ATP. Поэтому стабильность полученных комплексов (GroEL-O-R-димер, GroEL-ГАФД_ДТНБ) при их инкубации с Mg-ATP свидетельствовала о том, что нашей экспериментальной системе GroEL оказался “заблокирован” белком - субстратом. В связи с этим, было изучено влияние указанных форм ГАФД на GroEL-зависимый рефолдинг предварительно денатурированной термостабильной ГАФД B.st.. Как видно на рис.11, восстановление ферментативной активности при разведении денатурированной ГАФД достигает 20-25% и увеличивается до 50-55% в присутствии GroEL. Мутантные O-R-димеры не влияют на спонтанную реактивацию, но полностью блокируют GroEL-зависимую реактивацию фермента. Очевидно, что низкий для шаперонин-зависимой реактивации выход активного фермента можно объяснить ингибированием функционирования GroEL за счет образования прочного, недиссоциирующего в присутствии Mg-ATP комплекса шаперонина с O-R-димером. Аналогичный результат был получен в экспериментах по изучению влияния модифицированной ГАФД_ДТНБ на процесс спонтанной и шаперонин-зависимой реактивации денатурированной ГАФД B.st. Мы также не обнаружили эффекта модифицированной ГАФД_ДТНБ на спонтанный рефолдинг термостабильной ГАФД B.st., но в тоже время наблюдали ингибирование GroEL-зависимой ренатурации, как и в случае мутантных O-R-димеров.

Дополнительные подтверждения того, что ингибирование функционирования GroEL-зависимой ренатурации ГАФДB.st. является следствием связывания шаперонина с неспособным свернуться белком, были получены в следующих экспериментах. Мы использовали моноклональные антитела клона 6G7, полученные к ГАФД из мышц кролика и специфически взаимодействующие с ее ненативными формами и не взаимодействующие ни с одной из форм термостабильной ГАФД. Результаты представлены на рис 12. Преинкубация шаперонина с модифицированной ГАФД из мышц кролика приводит к ингибированию GroEL-зависимой ренатурации денатурированной ГАФД B.st..

Однако если до внесения в среду реактивации шаперонина ГАФ_ДДТНБ преинкубировать с антителами клона 6G7, то мы будем наблюдать восстановление активности денатурированной ГАФД B.st. до уровня, характерного для GroEL-зависимой реактивации. Т. е. антитела связывали модифицированную ГАФД, тем самым, предотвращая ее взаимодействие с GroEL и, следовательно, ингибирование шаперонина.

Т

GroEL


- GroEL

 GroEL,  Y283V/W84F

 GroEL,  Y283V/W84F


аким образом, мы получили убедительные доказательства того, что связывание шаперонина с модифицированной ГАФД блокирует GroEL-зависимый рефолдинг термостабильной ГАФД B.st..

Р

ис.11. Влияние OR-димеров ГАФД_B.st. Y283V/W84F на реактивацию ГАФД_B.st.

Денатурированную в 8М мочевине ГАФД разводили буфером для реактивации и инкубировали без добавок, в присутствии GroEL, в присутствии димеров, а также при одновременном добавлении димеров и GroEL. В опытах использовали димеры Y283V/W84F.




Рис. 12. Влияние ГАФД_ДТНБ и антител 6G7 на реактивацию ГАФД_B.st.

Денатурированную в 8М мочевине ГАФД разводили буфером для реактивации и инкубировали без добавок (синие столбики) или в присутствии GroEL (красные столбики). К пробам добавляли ГАФД_ДТНБ и/или и антитела.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что появление в клетке вследствие мутаций, действия ядов, лекарственных препаратов или в процессе окислительного стресса, поврежденных белков, способных связываться с шаперонином, может приводить к образованию прочных недиссоциирующих комплексов. Результатом этого будет уменьшение количества свободных шаперонов, способных облегчать фолдинг своих нормальных клеточных субстратов и, как следствие, увеличение содержания неправильно свернутых и денатурированных белков.

Следует отметить, что в клетке рефолдинг и предотвращение агрегации денатурированных белков осуществляют шапероны различной степени сложности. Так, наряду с крупными мультисубъединичными шаперонинами (сходными с GroEL) важную роль играют малые белки теплового шока. Для имитирования их деятельности ранее в нашей лаборатории были использованы полиэлектролиты разного размера, заряда и гидрофобности (полианионы и поликатионы различной природы). В этой работе мы проверили действие природных положительно заряженных белков (протаминов, выделенных из лососевых рыб) на предотвращение агрегации олигомерного фермента –глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и мономерного белка, идентичного по размерам субъединице ГАФД, - ренина (37 кДа). На рис.13 представлено влияние протамина и, для сравнения, синтетического алкилированного поли-N-алкил-4-винилпиридиниевого катиона со степенью полимеризации 1600. Из приведенных данных следует, что протамины оказывают сходное с синтетическими поликатионами антиагрегационное действие на олигомерный фермент ГАФД. Более эффективно действие протаминов на предотвращение агрегации ренина (рис.13). Вероятно, это связано не только с мономерным строением ренина, но и с более низкой изоэлектрической точкой этого белка (рI для ГАФД и ренина равны соответственно 8,5 и 5,6), что облегчает его взаимодействие с положительно заряженными белками.



Рис. 13. Термоагрегация ГАФД и ренина в присутствии синетического поликатиона и протаминов. 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержащий 0,5 мМ ЭДТА. Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, концентрация ренина 2,5 мкМ, концентрация заряженных групп поликатионов 5 мМ, концентрация протаминов 1 мг белка в мл, температура 60°С.

Таким образом, можно предположить, что наряду с применением молекулярных шаперонов для ренатурации белков и предотвращения их агрегации в простейших случаях можно использовать искусственные шапероны, созданные как на основе синтетических полиионов, так и на основе природных полимеров, в том числе и положительно заряженных протаминов.

5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ, ИНАКТИВИРУЮЩИХ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗУ.

Одним из малоизученных свойств антител является их потенциальная способность изменять конформацию белков, связывающихся с ними. Мы предположили, что антитело, выработанное на ненативную конформацию антигена, при связывании с нативным белком может индуцировать его превращение в аналогичные ненативные структуры. Одной из задач настоящей работы была экспериментальная проверка такой возможности на примере антител к ненативным формам ГАФД. Выбор ГАФД в качестве объекта исследования был продиктован как обширной информацией о роли этого фермента в функционировании клетки (особенно при патологических изменениях), а так и большим опытом работы с этим белком в наших исследованиях. Нами была получена кроличья антисыворотка, содержащая антитела против ГАФД из B. stearothermophilus, а затем проведено выделение фракций поликлональных антител, специфически реагирующих с различными формами ГАФД. Суть подхода отбору антител, способных оказывать инактивирующее воздействие на антигены-ферменты, заключается в следующем. Если белок может существовать в двух конформациях (например, активный и неактивный фермент и т.д.), то антитела, выработанные на одну конформацию, при взаимодействии с белком, находящимся в другой конформации, могут вызывать изменения его свойств в процессе образования комплекса фермент-антитело. Мы предположили, что можно выделить из поликлональной антисыворотки антитела, эффективно связывающиеся с определенными конформационными состояниями антигена-фермента. Если такие антитела будут связываться (пусть и с меньшим сродством) с другими конформациями белка, то в процессе окончательного формирования многоточечного контакта между активным центром антитела и антигенной детерминантой могут происходить такие нарушения исходной конформации фермента, которые должны вызывать снижение или потерю его каталитической активности. В принципе благодаря такому подходу можно было бы с помощью антител задавать белкам "нужную" конформацию". Для того чтобы проверить высказанное предположение мы приготовили аффинный сорбент на основе неактивных иммобилизованных тетрамеров ГАФД, ковалентно связанных с сефарозой за одну из 4 субъединиц.


Н
а рисунке 14 представлено влияние двух типов антител на активность ГАФД B. Stearothermophilus.

При инкубации холоГАФД с антителами на неактивную апоформу, активность фермента снижалась на 80-85% (кривая 1). При этом те же антитела инактивировали апоформу ГАФД не более чем на 25% от исходной активности (кривая 2). При инкубации апо- и холо-ГАФД с антителами на денатурированную форму активность ферментов практически не изменялась.

Для получения достаточно стабильной конформации тетрамера "закрепили" такую конформацию с помощью поперечно-сшивающего реагента – глутарового альдегида. Фракцию иммуноглобулинов G наносили на иммуносорбент, а элюцию сорбировавшихся антител проводили буферным раствором с рН 2,3. Эту фракцию антител мы будем называть "антитела на неактивную апоформу ГАФД". Иммуносорбент для выделения антител, специфичных к денатурированной форме ГАФД, получали путем денатурации иммобилизованной ГАФД в буферном растворе с рН 2,3 Антитела, несвязавшиеся с предыдущим иммуносорбентом (неактивными тетрамерами ГАФД) наносили на иммобилизованные денатурированные мономеры ГАФД, проводили элюцию при рН 2,3 и получали "антитела на денатурированную форму". С помощью метода иммунопреципитации антител иммобилизованным Protein G было показано, что уровень перекрестной реакции между двумя фракциями антител составляет приблизительно 15 %, причем антитела на неактивную апоформу ГАФД достаточно эффективно связываются с нативными холотетрамерами ГАФД.

Апо- (2 и 4) или холоГАФД (1 и 3) (0,5 мг/мл) инкубировали с антителами на неактивную апоформу (1 и 2) или на денатурированную форму (3 и 4) в эквимолярном соотношении.

С помощью метода иммунопреципитации с Protein G было показано, что антитела на неактивную апоформу связываются с апоферментом практически так же, как и холоферментом. При этом антитела на денатурированную форму слабо взаимодействовали как с апоферментом, так и с холоферментом. Были также получены комплексы антитело-антиген в изолированном состоянии, определена стехиометрия связывания двух белков и полученные комплексы исследованы методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Из данных седиментационного анализа следует, что в комплексе антиген-антитело на один тетрамер ГАФД (апо или холоформа с мол. массой 144 000 Да, S_w,20 около 6,5 ) связывается только одна молекула антитела с мол. массой 150 000 Да. На рис. 15 продемонстрированы полученные с помощью ДСК графики избыточного теплопоглощения апо- и холоГАФД Bacillus stearothermophilus, антител на неактивную апоформу и комплекса ГАФД с этими антителами. Видно, что кофактор NAD обладает сильным стабилизирующим эффектом на структуру молекулы фермента – Tmax холофермента сдвигается в теплую область примерно на 15 градусов по сравнению с Tmax апофермента.

Но температура термоденатурационного перехода (Tmax) комплекса антиген-антитело и в присутствии и в отсутствие кофактора NAD практически одинакова и близка к Tmax апоформы ГАФД Bacillus stearothermophilus. Таким образом, антитела на апо-форму, взаимодействуя с холоферментом, элиминируют стабилизирующий эффект кофактора и дестабилизируют молекулу фермента. Для апофермента конформационные различия между свободным и связанным с антителом ферментом минимальны.


Рис. 15 Кривые избыточного теплопоглощения апо- (1) и холоГАФД (2)

B.stearothermophilus, антител на неактивную апоформу (3,4), а также комплекса апо- и холоГАФД Bacillus stearothermophilus:Ат на неактивную апоформу (5 и 6, соответственно






Как говорилось выше, апофермент имеет такое же, как и холофермент сродство к данной фракции антител, причем в обоих случаях связывается только одна молекула антитела на тетрамер фермента. Это означает, что в случае апоформы ГАФД взаимодействие антитела инактивирует полностью только ту субъединицу фермета, с которой она связана. Иная ситуация наблюдается для холоформы фермента – связывание антитела только с одной субъединицой приводит к постепенной инактивации всех остальных субъединиц и к снижению стабильности молекулы в целом. Вероятно, если в составе холофермента даже одна субъединица изменяет свою конформацию, то и соседние субъединицы уже не могут эффективно функционировать.

Н
ами было исследовано влияние двух типов антител на процесс реактивации ГАФД. Необходимо было выявить, с какими формами ГАФД связываются разные типы антител, то есть через процесс реактивации исследовать свойства самих антител. Было показано, что спонтанная реактивация ГАФД B. stearothermophilus достигала 85 % (рис.16, кривая 1).

Реактивация в присутствии антител на неактивную апоформу ГАФД достигала 70 % через 10 мин., далее активность начинала постепенно уменьшаться (до 15% от исходной активности) (кривая 3). В присутствии антител на денатурированную форму активность достигала только 18 % и больше не изменялась (кривая 2). Следовательно, в присутствии антител на неактивную апоформу ГАФД на первой стадии белок беспрепятственно сворачивается, но, как только возникает нативная конформация, антитела начинают связываться с таким ферментом и инактивировать его.

Рис. 16. Влияние антител на неактивную апоформу (3) и на денатурированную форму фермента (2) на реактивацию ГАФД B. stearothermophilus . 1 – спонтанная реактивация ГАФД

В присутствии антител на денатурированную форму мы видим небольшое увеличение активности до 20% , но на этом процесс реактивации прекращается. Мы полагаем, что антитела на развернутую форму еще на раннем этапе рефолдинга связываются с интермедиатами ГАФД и не дают им возможности продолжить сворачивание.

Таким образом, полученные результаты позволяют нам заключить, что фракция антител на ненативную апо-форму способна инактивировать фермент и не препятствует процессу ренатурации. Фракция антител, специфичная к денатурированной ГАФД, способна блокировать процесс ренатурации, но не может выступать, как инактивирующий агент.

Подробное исследование температурной и временной зависимости инактивации разных форм ГАФД антителами позволило предположить, что связывание антител на неактивную апоформу способно индуцировать развивающуюся во времени инактивацию фермента согласно приведенной на рис. 17 схеме.

Извлеченные на иммобилизованных неактивных тетрамерах ГАФД антитела неактивную апоформу (I) связываются не только с антигенными

детерминантами, характерными для неактивной формы, но и с антигенными детерминантами, присутствующими в холо- и апоГАФД.

Вероятно, связывание этих антител с холо- или апоформами индуцирует образование такой конформации ГАФД, которая близка к конформации неактивного фермента, сшитого глутаровым альдегидом, т.е. конформации, на которую было отобрано данное антитело (Рис. 15, II и III).

В том случае, если такая возможность близка к истине, поведение антитела типа 1 можно рассматривать в рамках концепции, согласно которой антитело способно индуцировать некоторое искажение (или «напряжение») структуры партнера, образующего с ним комплекс, изменяя его конформацию в соответствии с конформацией антиген-связывающего центра.