Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» методические указания

Вид материала

Методические указания

Содержание Клонирование методом лимитирующих разведений. Клонирование в полужидком агар-агаре. Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Замораживание и оттаивание гибридомных клеток Методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками Первый этап скринирования Иммуноферментный метод. Радиоиммунологический метод

Подобный материал:

• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 952.2kb.
• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: ст преподаватель, 451.34kb.
• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 200 г. Автор: канд техн, 983.06kb.
• Директор Инженерной Академии д вет н., профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 433.94kb.
• Директор Инженерной Академии Докт вет наук, профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 1007.64kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преподаватель Чернетченко, 370.81kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: д т. н.,профессор Никифоров, 453.83kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп., магистр Плевако, 410.07kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп. Харченко, 566.59kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: преп. Жумагулов, 428.14kb.

Практическая работа № 7

Клонирование гибридомных клеток


Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибри­домных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клет­ки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гипоидные клетки.

К основным методам клонирования клеток относятся клони­рование методом лимитирующих разведений, клонирование в по­лужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточ­ного цитофлуори метра.

Клонирование методом лимитирующих разведений. Этот ме­тод является наиболее распространенным. При первом клонировании активной, т. е. продуцирующей антитела, может оказаться только небольшая часть клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при ко­тором доля положительных клонов будет возрастать.

Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же виды клеток, что и для начального роста гибридом. Важно употреблять отобранные, как описано выше, партии сыворотки и добавлять ее в количестве 15—20%.

Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар (P. Coffino и сотр., 1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Ниж­ний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культи­вирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который вклю­чаются клонируемые клетки. При использовании клеток питаю­щего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добав­лением нижнего слоя агара.

Для приготовления агарового слоя смешивают равные части среды культивирования двойной концентрации и 0,6% агар-агара в дистиллированной воде, затем помещают в водяную баню на 43—44°С до употребления. Клетки добавляют в минимальном объеме и сразу же заливают в чашку Петри, после чего остав­ляют ее на некоторое время при комнатной температуре до за­твердевания агара.

Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Д. Парке с сотр. (1979) предложили модификацию проточного цитофлуориметра, позволяющую осуществлять клонирование ин­дивидуальных клеток. Для этого приготавливают флуоресцент­ные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что позволяет выделять их на этом приборе.

После выделения тем или иным способом положительных клонов клетки этих клонов размножают в достаточном коли­честве и образцы их замораживаются.

Замораживание и оттаивание гибридомных клеток

Замораживания клеток.

1. Готовят среду для заморажива­ния клеток, состоящую из среды культивирования, 20% СПК и 10% диметилсульфоксида. Полученную среду стерилизуют через фильтры и хранят при 4°С.

2. Осаждают клетки центрифугированием при 200g, 4°C, к осадку добавляют необходимое количество холодной серы для замораживания, исходя из количества размораживаемых ампул: 1 мл среды на (2—5) • 106 клеток. Клетки осторожно ресуспен-дируют в этой среде.

3. Полученную суспензию разливают по 1 мл в стерильные пластиковые ампулы на 2 мл с завинчивающимися крышками; при этом следует избегать смачивания верхней части ампулы. Плотно завинчивают ампулу пробкой.

Замораживание можно производить двумя способами.

1. Помещают ампулы в штатив, который ставят в коробку из пенопласта с толщиной стенок около 1 см и с крышкой. За­крытую коробку ставят на 1 сут в морозильник на —70°С,
   после чего пробирки переносят в жидкий азот.
   
2. Клетки можно заморозить в парах жидкого азота. Для этого изготавливают плотно закрываемую камеру (лучше всего из пенопласта с толстыми стенками), укрепляют в ней штатив для ампул на высоте 10—15 см выше дна, а также ампулы с клетками и наливают на дно жидкий азот (в поставленную на дно металлическую посуду). Камеру плотно закрывают и остав­ляют на 1—2 ч, после чего ампулы переносят в жидкий азот. Очевидно, что устройство камеры (толщина стенок, герметич­ность) должно быть таким, чтобы за это время весь жидкий азот не успел испариться.
   

При отсутствии в лаборатории резервуара с жидким азотом клетки можно некоторое время (несколько месяцев) хранить при —70°С (R. Patel et. al., 1984).

Размораживание клеток. Замороженные культуры вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспен­зию клеток переносят пастеровской пипеткой в пробирки на 50 мл, содержащие не менее 10 мл холодной питательной среды, отмывают один раз 20—30 мл холодной среды и подсчитывают число жизнеспособных клеток. Клетки засевают в разных раз­ведениях, так как окраска трипановым синим часто не выявляет значительную долю поврежденных клеток, которые могут погиб­нуть в первые сутки культивирования.

Методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками

Какой бы метод детекции антител ни был выбран, его надо отработать до начала получения гибридом, так как потом на это не будет времени. Основные требования к методу детекции — надежность и быстрота. Проверке должно подвергаться сразу большое число проб. Точное количественное определение титра антител на данной стадии не требуется.

Первый этап скринирования — стерильный отбор проб, ко­торый осуществляют с помощью пастеровских пипеток. Однако при необходимости тестировать несколько сотен культуральных жидкостей используют многоканальные пипетки (Flow Labs, Анг­лия) или специальные приспособления для переноса надоса-дочных жидкостей сразу из 96 лунок.

Основными методами скринирования культуральных жидко­стей с целью выявления антител к иммунизирующему антигену являются иммуноферментный, радиоиммунологический и иммунофлуоресцентный методы.

Иммуноферментный метод. В данном методе используют ан­титела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные фер­ментом, и о результате реакции судят по появлению цветной реакции. Принцип метода следующий. Растворимый антиген или клетки связывают с лунками 96-луночного планшета для микротитрования, приливают культуральную жидкость, в ко­торой могут быть антитела, и после инкубации добавляют конъюгированные с ферментом антитела против иммуноглобулинов мыши. После инкубации и отмывки в лунки наливают раствор субстрата. Если в культуральной жидкости были антитела против антигена, то они адсорбируются на антигене, на них в свою оче­редь адсорбируются конъюгированные с ферментом вторичные антитела и под действием фермента происходит разложение субстрата и переход его в окрашенный продукт. Таким образом, по появлению окраски судят о присутствии в культуральной жидкости антител к иммунизирующему антигену.

Радиоиммунологический метод. Постановку РИМ осуществля­ют следующим способом. На предварительном этапе готовят препарат иммуноглобулина кролика против иммуноглобулинов мыши и метят его радиоактивным йодом.

Контрольные вопросы

1. Что представляет собой клонирование?
   
2. Что представляют собой гибридомные клетки?
   
3. Как просисходит клонирование методом лимитирующих разведений?
   
4. Как происходит замораживание гибридомных клеток?
   

5. Какие существуют методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками?


Задания для СРСП:

1.Иммуноферментный метод выявления антител.

2. Радиоиммунологический метод выявления антител.


Задание для СРС:

Оформить результаты практической работы № 7. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП.

Рекомендуемая литература


Обязательная:

1. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию. - М.: Пищевая промышленность, 1978.
   
2. Биотехнология сельскохозяйственных растений./ Пер. с англ. - М.: Агропромиздат, 1987.
   
3. Биотехнология. Теория и практика. - Алматы.- Периодический журнал Национального центра по биотехнологии РК, 1996-2001 г.
   
4. Богданов В.М., Баширова Р.С., Кирова К.А. и др. Техническая микробиология пищевых продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1968.
   
5. Валиханова Ш. Биотехнология растений. - Алматы, 1997.
   
6. Егоров М.Д. и др. Биотехнология. - т.1-7.- М.: Высшая школа, 1987.
   

Дополнительная:

1. Пирузян Э.С. Генетическая инженерия растений. - М.: Знание, 1988.
   
2. Сассон А. Биотехнология. Свершения и надежды. - М.: Мир. 1987.
   
3. Смирнов В. и др. Антибиотики.- Киев.: Высшая школа, 1989.
   
4. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология.- М.: Агропромиздат, 1991.
   
5. Экологическая биотехнология./Под ред. Форстера и Вейда./ пер. с англ.- Л.: Химия, 1990.