Geum.ru

Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» методические указания

Вид материалаМетодические указания

Содержание


Ход работы.
Получение жизнеспособных протопластов
Таблица 1. Среды для культивирования протопластов табака и картофеля, рН 5,7
Практическая работа № 4Культивирование животных клеток.
Питательные среды и условия культивирования
Системы культивирования клеток
Проточные культуры
Суспензионные культуры
Культивирование органов
Подобный материал:
1   2   3   4   5

Ход работы. За сутки до опыта готовят ферментный раствор для выделения протопластов из мезофилла листа. Ферментная смесь содержит 0,5%-ную целлюлозу, 0,5%-ную мацеразу, 0,2%-ную дреселлазу, которую растворяют в растворе сахарозы (0,5 моль/л) и CaCl2 (50 ммоль/л), рН 5,5-5,6. Приготовленный раствор центрифугируют для осаждения нерастворимых частиц в течение 10-15 мин при 1,5-2 g. После доведения рН до 5,5-5,6 раствор при помощи шприца с насадкой фильтруют через фильтр в чашки Петри по 7-10 мл в каждую.

Молодые листья табака от растений, выращенных в асептических условиях, переносят в стерильные чашки Петри и нарезают узкими полосками или елочкой. Затем листья сразу помещают на поверхность ферментного раствора. Чашки переносят в термостат при 28-300С на 15-18 ч. Для 1 г ткани достаточно 10 мл ферментного раствора. Контроль за ферментацией осуществляют с использованием инвертированного микроскопа. Аналогичным образом можно провести ферментацию из растений любых видов, но при этом следует изменить состав раствора. Так, для выделения протопластов из мезофилла картофеля применяют смесь, состоящую из 1%-ного целлюлазина, 0,5%-ной мацеразы и 0,1%-ной дреселлазы. После ферментации содержимое чашки фильтруют через нейлоновый фильтр в пустую стерильную колбу. Затем пипеткой суспензию, содержащую протопласты, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 1g. Протопласты всплывают на поверхность. Их отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, заполненную до половины средой W-5 (табл.1 приложения). Протопласты центрифугируют в этой среде 2 мин при 700 g, для того чтобы отмыть от остатков ферментной смеси. Отмывку проводят дважды. При центрифугировании в питательной среде W-5 протопласты осаждаются. Это последний этап в процессе их выделения. В некоторых случаях рекомендуют центрифугирование смеси в градиенте сахарозы, тогда протопласты формируют кольцо на поверхности среды. Отбирают их также пастеровской пипеткой. Индукция морфогенеза (стеблей и корней) в каллусе приводит к образованию растений-регенерантов (рис. 38).




Получение жизнеспособных протопластов

Существует специальный метод определения жизнеспособности, т. е. метаболической активности протопластов по окрашиваемости их флуоресцеиндиацетатом (ФДА). ФДА - это нефлуоресцирующее соединение, которое легко проходит через плазматическую мембрану протопластов, но только в живых протопластах расщепляется эстеразами. Расщепление приводит к высвобождению флуоресцеина, который задерживается лишь внутри протопластов с интактными мембранами. Метаболически актив­ные (жизнеспособные) протопласты в ультрафиолетовом свете становят­ся визуально различимыми по зеленому свечению благодаря возбужде­нию накопленного флуоресцеина.

Качество суспензии протопластов определяется процентом жизнеспо­собных протопластов. Подсчет протопластов проводят в камере Фукса - Розенталя. Плотность протопластов (количество в 1 мл суспензии) - важ­ная характеристика, определяющая их начальный выход и необходимая для всех последующих манипуляций с ними. Хорошим выходом прото­пластов считается получение от 1x106 до 5x106 жизнеспособных прото­пластов из 1 г сырой массы ткани растения или культивируемых клеток.

Отмытые от ферментного раствора жизнеспособные протопласты вы­ходят из состояния шока, в них наблюдается репарация поврежденных структур и начинается подготовка к регенерации стенки. В изотоническом полноценном питательном растворе в асептических условиях протоплас­ты могут существовать в течение многих дней и недель и сохранять спо­собность к делению.


Таблица 1. Среды для культивирования протопластов табака

и картофеля, рН 5,7


Компоненты, мг/л
W-5
K-3
W-S-S
SH-1
SH-2
RMOP

NaCl
9000















NH4NO3



250
1280






1650

KNO3



2500



1900
1900
1900

CaCl2 . 2H2O
18400
900
600
440
440
440

MgSO4 . 7H2O



250
300
370
370
370

KH2PO4






170
170
170
170

KCl
800



300









NaH2PO4 . H2O



150












(NH4)2SO4



134












NH4Cl









267
267



Fe-хелат



250
250
250
250
250

H3BO3



3
6
6
6
6

MnCl2 . 4H2O






24
24
24
24

ZnSO4 . 7H2O



2
10
10
10
10

CuSO4 . 5H2O



0,025
0,025
0,025
0,025
0,025

CoSO4 . 7H2O



0,025
0,025
0,025
0,025
0,025

Ki



0,75
0,83
0,83
0,83
0,83

Na2МoO4 . 2H2O



0,25
0,25
0,25
0,25
0,25

MnSO4 . 7H2O



14












Мезоинозит



100
100
100
100
100

Глицин









2
2



Никотиновая кислота



1
1
5
5



Фолиевая кислота









0,5
0,5



Биотин









0,05
0,05



Аденинсульфат









40
80



Гидролизат казеина






500
300
100



В1



10
10
0,5
0,5
10

В6



1
1
0,5
0,5
1

НУК



0,2
2
0,1






ИУК












0,1
0,1

2,4-Д



1
0,2









БАП



0,2
0,5
0,5



1

Зеатин












0,5



Сахароза



10000



2500
2500
10000

Глюкоза
1000



7200









Ксилоза






250









Маннитол



72800



54600
34600





Контрольные вопросы
  1. Что представляет собой протопласт?
  2. Что представляет собой энзиматический путь получения изолированных протопластов?
  3. В чём заключается соматическая гибридизация?
  4. От чего зависит успешное выделение протопластов?
  5. Какие существуют методы определения жизнеспособности протопластов?


Задание для СРСП:

1. Получение жизнеспособных протопластов

2. Определения жизнеспособности протопластов


Задание для СРС: оформить результаты практической работы № 3. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП.


Практическая работа № 4
Культивирование животных клеток.

В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток:
- культуры клеток;
- культуры органов и тканей (органные культуры).
Питательные среды и условия культивирования
После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т.е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.
Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования.


Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться на нем. В связи с этим встает вопрос о подходящем материале. В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов. Стекло лучше всего пирекс (алюмоборосиликатное стекло), так как натрийсиликатное стекло может подщелачивать среду и его необходимо кипятить в слабой кислоте перед употреблением. С каждым использованием пригодность такого стекла падает. Пластик - чаще всего используют полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и другие. Металлы - подходит как нержавеющая сталь, так и титан, так как эти вещества химически инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Этого можно достичь химической обработкой окисляющими агентами или физическими воздействиями (высоковольтным разрядом, ультрафиолетовым светом, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами). Фирмы, производящие пластиковую посуду, используют эти методы. Некоторые исследователи, несмотря на это, предпочитают даже новую посуду перед посадкой клеток обрабатывать смесью концентрированной серной кислоты и бихромата калия (хромовая смесь), после чего следует тщательная промывка. Иногда поверхность сосуда покрывают веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто для этого используют коллаген и полиаминокислоты.

Системы культивирования клеток

Существует две основных системы культивирования клеток.
1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.
Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:
- прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);
- постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);
- перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды. Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.
Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.
2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.
Существует два крупных направления в культивировании животных клеток: монослойные культуры и суспензионные культуры.
Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.
Монослойные культуры обладают рядом преимуществ:
1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей пит.среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, напр. при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
3. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.
5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.
Недостатками монослойных культур являются:
- требования большого пространства;
- возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;
- недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;
- сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.
Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления (рис.1):



1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).
2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 15-20% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

Культивирование органов
Органная культура - культивирование in vitro органа или части органа, в которых сохраняются анатомическая связь и функционирование тканей, максимально приближенные к таковым в условиях in vivo, то есть в организме. Миграция изолированных клеток на периферии экспланта подавляется специальными условиями культивирования, в результате чего могут даже образовываться дифференцированные структуры. Например, на периферии эксплантов легочной ткани развиваются новые мелкие бронхи, состоящие из альвеол, окаймленных бронхиальным эпителием.
Органная культура сохраняет межклеточные взаимодействия, в течение долгого периода поддерживает гистологическую и гистохимическую дифференцировку, как правило, остается в не растущем состоянии в течение нескольких дней и даже недель. Эти культуры не способны к размножению.
Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, эндокринные органы продолжают секрецию специфических гормонов и т.д. Наибольшее сходство процессов морфогенеза in vivo и in vitro отмечено для эмбриональных тканей.
Существует несколько видов техники культивирования органов. В качестве субстрата можно использовать сгусток плазмы. Этот способ был предложен Феллом и Робинсоном и получил название "техника часового стекла", став классической техникой морфогенетического анализа эмбриональных органов (рис.2)
Культивирование проводят во впадине часового стекла на поверхности сгустка, состоящего из плазмы цыпленка и эмбрионального экстракта кур. Часовое стекло помещают в чашку Петри и закрывают сверху влажной ватой или фильтровальной бумагой для предотвращения высыхания. Культивируют в термостате при 37,5оС. Существуют модификации этого метода, при которых часовое стекло покрывается крышкой, приклеенной воском и другие. Недостатком метода, ограничивающим применение его в биологических исследованиях, является разжижение сгустка в окрестностях экспланта, который в результате оказывается в жидкости. Кроме того, сложный состав среды затрудняет проведение биохимических исследований.



Рис.2. Метод часовых стекол (по Феллу и Робинсону, 1929)

Эти недостатки устраняются при использовании сгустка агара. Такая техника была предложена Спраттом (рис.3). Метод основан на получении агарового геля 1 - 4% концентрации, основу которого составляют забуференные солевые растворы или питательные среды типа 199 с добавлением эмбриональной сыворотки.



Рис.3. Метод часовых стекол с агаровым сгустком (по Вольффу и Хафену, 1952)

В середине 20-го века Чен обнаружил, что культуры можно выращивать на бумажных плотиках, плавающих на поверхности жидкости в часовом стекле. С целью улучшения техники позднее бумагу обрабатывали силиконом, комбинировали с миллипоровыми фильтрами, а затем перешли на плотики из ацетата вискозы. Этот материал хорошо растворяется в ацетоне, что облегчает подготовку ткани для гистологического анализа.
Метод культивирования на плотиках не лишен недостатков, основной из них - погружение ткани в среду при затоплении плотика. Решение этой проблемы было предложено Троувеллом, который предложил культивировать органы на поверхности металлической сетки (рис.4). Сетка представляет собой квадрат размерами 25*25 мм с отогнутыми краями, образующими четыре ножки высотой около 4 мм. Скелетные ткани культивируют непосредственно на сетке, тогда как мягкие вначале эксплантируются на бумагу, а затем помещаются на сетку.



Модифицированный метод Троувелла (по И. Ласнитски, 1989)

В 1976 году, для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и др. был предложен метод поочередного культивирования в жидкой среде и газовой фазе. Для этого экспланты прикрепляются ко дну пластикового сосуда и покрываются средой. Сосуды помещают в камеру с определенным газовым составом, а камера помещается на качающуюся платформу.

Контрольные вопросы

1.Что представляют собой культуры клеток?

2. Что представляют собой культуры органов и тканей (органные культуры)?

3. Как происходит культивирование в плоских флаконах (матрацах)?

4. Как происходит культивирование во вращающихся бутылях?

5. Как происходит культивирование в колонках на микроносителях?


. Задание для СРСП:
  1. Метод часовых стекол.
  2. Культивирование органов.


Задание для СРС: оформить результаты практической работы № 4. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП.