Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» методические указания

Вид материала

Содержание

Стерилизация стеклянной посуды
Подготовка посуды к стерилизации.
Стерилизация инструментов и приборов
Стерилизация газообразными веществами
Стерилизация облучением
Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов
Практическая работа № 2
Материалы и оборудование.
Ход работы.
Практическая работа № 3 Выделение протопластов из мезофилла листа
Материалы и оборудование.

Подобный материал:

1 2 3 4 5

СТЕРИЛИЗАЦИЯ СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ

Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180° в течение 1—3 ч. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации. Они различаются по форме и способам обогрева, но имеют сходное устройство. Их делают из термостойких материалов — обычно из металла и асбеста. Внутри стерилизатора имеются полки для размещения посуды, а наверху отверстие, в котором с помощью пробки
укрепляют термометр. У стенки стерилизатора (шкафа) или вблизи греющей
поверхности температура всегда значительно выше, чем внутри, поэтому ртутный шарик термометра должен находиться внутри шкафа на расстоянии 6—8 см от верх
ней стенки. В верхней части сушильных шкафов имеется также отверстие для вентиляции, которое при стерилизации закрывают. Стерилизаторы и шкафы с электрическим обогревом снабжены терморегулятором, обеспечивающим автоматическое поддержание
необходимой температуры.

Подготовка посуды к стерилизации. Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Посуду развертывав

ют непосредственно перед употреблением. В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны. Торчащие из пипеток волокна ваты сжигают в пламени горелки. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с оттянутого конца и постепенным движением бумаги по спирали заканчивают у конца с ватным тампоном. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов перед стерилизацией упаковывают по нескольку штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Чашки Петри обычно заворачивают в пакеты по 2—4 штуки, шпатели — обязательно по отдельности, но затем, как и пипетки, их объединяют в общий сверток. Колбы, пробирки и трубки Бурри закрывают ватными пробками. На пробки можно надеть бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли.

Стерилизация. Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный, надежный прогрев стерилизуемого материала. Стерилизатор (сушильный шкаф) во время работы должен быть плотно закрыт. При отсутствии терморегулятора, необходимо строго следить за температурой, так как при понижении ее не осуществится стерилизация, а при нагреве выше 180° бумага и пробки начинают обугливаться. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80°, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Лучше всего .выгружать посуду только после того, как температура в стерилизаторе сравняется с комнатной.

Посуду можно стерилизовать и в автоклаве. Режим стерилизации в этом случае существенно зависит от объема сосудов и толщины стекла. Для автоклавирования посуду готовят, как и для сухожаровой стерилизации. Следует иметь в виду, что в автоклаве посуда увлажняется.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И ПРИБОРОВ

Мелкие металлические инструменты: петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели стерилизуют прокаливанием в пламени (т. е. нагреванием докрасна) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160° либо в собранном, либо в разобранном виде. В первом случае длительность стерилизации 75 мин, во втором — 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань. Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 ати в течение 15—20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются. Прокаливать шприцы нельзя, так как от этого они портятся.

Термостойкие приборы для культивирования микроорганизмов, а также детали к этим приборам, резиновые пробки и шланги стерилизуют в автоклаве. При этом емкости закрывают в бумагу. Режим автоклавирования выбирают в соответствии с термостойкостью материала, из которого сделан прибор.

Некоторые предметы (металлические инструменты, мелкие стеклянные детали, мембранные фильтры) иногда стерилизуют длительным (в течение 30—60 мин) кипячением в дистиллированной воде. Металлические и стеклянные предметы лучше всего кипятить в специальных закрытых сосудах — стерилизаторах. Можно использовать для этой цели и металлическую посуду. Мембранные фильтры обычно кипятят в колбе или химическом стакане, закрытых ватными пробками. Однако этим способом с целью стерилизации в микробиологической практике пользуются редко в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильность, так как споры некоторых анаэробных микроорганизмов сохраняют жизнеспособность даже после кипячения в течение нескольких часов. Надежность стерилизации при кипячении может быть увеличена внесением в воду какого-либо бактерицидного средства: 2%-ного формальдегида, 0,1%-ной сулемы или 1%-ной бриллиантовой зелени. Но в этом случае возможно загрязнение биоцидами стерилизуемых предметов.

Стерилизация газообразными веществами

Аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глю-таральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Особенно эффективна смесь оксида этилена и бромистого метила в массовом соотношении 1:1,44 (смесь «ОБ»).

Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах. Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают, как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. Для упаковки используют материалы, не портящиеся в газовой среде и пропускающие газ и влагу: оберточную бумагу, муслин, хлорвиниловые и нейлоновые пленки. Перед введением в камеру биоцида из нее как можно полнее удаляют воздух, чтобы обеспечить тесный контакт активно действующего вещества со стерилизуемым объектом. При стерилизации строга контролируют концентрацию газа, давление, влажность, температуру и длительность экспозиции. В большинстве случаев процесс проводят в сочетании с некоторым повышением температуры (до 45—70°). Режимы стерилизации разными газами неодинаковы. Они определяются прежде всего свойствами биоцида. Имеет значение и конструкция стерилизационного аппарата. Оптимальный режим стерилизации смесью «ОБ» при 50° в аппарате емкостью 100 л и более следующий: концентрация смеси 3,36 г/л (давление 1,2 ати), относительная влажность 80—100%, продолжительность 24 ч. По окончании стерилизации удаляют газы из камеры с помощью вакуумного насоса и на некоторое время камеру оставляют под вакуумом для десорбции газов из стерилизованных предметов. После этого камеру заполняют стерильным воздухом. Предметами, простерилизованными газами, рекомендуется пользоваться не ранее чем через 24 ч после стерилизации. Это необходимо для полного удаления из них газа. Целесообразно на этот период поместить их в вытяжной шкаф или оставить в хорошо проветриваемом помещении. Некоторые изделия из пластмасс требуют дополнительной аэрации до 9 суток. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами.

Стерилизация облучением

Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, a-, -, - радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используется ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см².

Основные способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов обобщены в таблице.

Следует отметить, что все большее распространение получают посуда и инструменты одноразового использования.

Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов

Стерилизуемый материал	Метод стерилизации	Режим стерилизации	Примечание
1	2	3	4
Питательные среды с почвенной вытяжкой; картофельные и неко торые другие натуральные среды	Автоклавирование	1,5—2 атм, 30 мин	в колбах, пробирках, бутылях и т д, закрытых ватными пробками
Жидкие и агаризованные среды не содержащие Сахаров и дру гих веществ, разлагающнхс при 120°	Автоклавирование	1 атм, 20 мин	то же
Жидкие и агаризованные среды с сахарами и другими соединениями, не выдерживающим нагревания при 120 °С	Автоклавирование	0,5 атм, 15—30 мин	то же
Среды или компоненты среды, не выдерживающие нагревания выше 100°	Дробная стерилизация	текучий пар, 3 раза по 30—40 мин через сутки	то же
Среды или компоненты сред, не выдерживающие нагревания, например, белки, некоторые витамины и аминокислоты	Фильтрование через бактериальные фильтры	-	-
Вазелиновое масло, глицерин, тальк	горячим воздухом	160°, 2 ч или 170°, 1 ч	слой вещества в сосуде не должен превышать 1,5 см
Чашки Петри, пипетки, шпатели	горячим воздухом	160-170^е, 2 ч	завернуты в бумагу (отверстия пипетки закрыты ватными тампонами)
Колбы, пробирки, химические стаканы, флаконы, стеклянные центрифужные пробирки, трубки Бурри	горячим воздухом	160—180°, 2 ч	закрыты ватными пробками
Шприцы	Горячим воздухом автоклавирование	160°, 1 ч 160°, 75 мин 1 атм, 15—20 мин	разобраны и завернуты в бумагу или ткань в собранном виде, в пробирке, закрытой ватной пробкой разобраны и завернуты
Мембранные фильтры	Автоклавирование кипячение	1 атм, 15 мин 30 мин	в сосуде с дистиллированной водой то же
Фильтры Зейтца	Автоклавирование горячим воздухом	1—1,5 атм, 20—30 мин 160°, 1 ч	цилиндр держателя закрыт ватной пробкой, в отводной трубке ватный тампон. Верхняя часть завернута в бумагу
Свечи Шамберлана и Беркефельда	Автоклавирование горячим воздухом	0,5—1 атм, 15 мин 160—170°, 2 ч	можно вместе с держателем закрыты ватными пробками, завернуты в бумагу и т. д., не должны быть соединены с новыми деталями
Стеклянные фильтры с держателем или отдельно	Автоклавирование	1 ати, 30 мин	закрыты ватными пробками, завернуты в пергамент и алюминиевую фольгу
Стеклянные фильтры без резиновых пробок	Горячим воздухом	1 атм, 20—30 мин	завернуты в бумагу
Центрифужные пробирки, изготовленные из термолабильных пластмасс	Газовая стерилизация Ультрафиолетовыми лучами	время экспозиции устанавливают экспериментально	пробирки после облучения хранят в стерильной посуде

Контрольные вопросы:

1. Каковы основные требования к структуре лаборатории клеточной биотехнологии

2. Каковы требования к персоналу лаборатории клеточной биотехнологии

3.Перечислить лабораторную посуду и аппараты, используемые в лаборатории клеточной биотехнологии

4.Какие методы обработки лабораторной посуды используют в лаборатории клеточной биотехнологии

5.Какие методы используют для получения посевного материала

Задание для СРСП:

1.Методы стерилизации.

2. Работа с культурами клеток.

Задание для СРС: оформить результаты практической работы № 1. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу. Составить 10 тестовых заданий по темам лекции и СРСП.

Практическая работа № 2

Приготовление питательных сред.

Цель. Приготовление питательной среды для культивирования клеток и тканей in vitro.

Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Мg⁺⁺. Железо используется в виде хелатов [FeО₄ или Fe₂O₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Cl^–, Н⁺ необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В₁, В₆, В₁₂), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Тиамин (В₁) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.

Пиридоксин (В₆) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н⁺ (отнятие Н⁺ от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

Ауксины: ИУК – -индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – -нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.

Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.

Гиббереллины: гиберрелловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P₁₀ и P₂₀₀.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4^оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20^оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов.

Ход работы.

В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить.
Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.
Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.
Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5-6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.
Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы.
Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).
Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.

Контрольные вопросы:

Каковы компоненты включают среды для выращивания растительных клеток и тканей.
На основе каких веществ готовят агаризованные среды.
Какова методика приготовления маточных растворов микро- и макросолей.
Какие существуют типы питательных сред.
Опишите методику приготовления жидкой питательной среды.

Задание для СРСП:

Применение фитогормонов в питательных средах для культивирования клеток и тканей.
Искусственные питательные среды.

Задание для СРС:

оформить результаты практической работы № 2. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу. Составить словарь определений по темам лекции и СРСП.

Практическая работа № 3
Выделение протопластов из мезофилла листа

Цель: получение жизнеспособных протопластов из мезофилла листа табака и картофеля.

Материалы и оборудование. Асептические растения. Стерильные среды (табл.1), ферменты. Чашки Петри диаметром 10 см, колбы на 50 мл, пастеровские пипетки, колбочки со стеклянными воронками и нейлоновыми фильтрами с диаметром пор 60 мкм, мерные пипетки на 1 и 10 мл, центрифужные пробирки на 10 мл, шприц с насадкой для фильтров и фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, пинцеты, скальпели, настольная центрифуга, инвертированный микроскоп.

Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. Массовое получение «голых» клеток стало возможным благодаря Э. Кокингу, который в начале 60-х годов разработал способ разрушения клеточной оболочки, не повреждающий живое содержимое клетки, и изолировал отдельные протопласты высших растений. Он обрабатывал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов и впервые получил изолированные протопласты энзиматическим путем.

Для обозначения процесса гибридизации с помощью слияния протопластов используются несколько терминов-синонимов: парасексуальная гибридизация, соматическая гибридизация, неполовая гибридизация. Однако значительно чаще используется термин «соматическая гибридизация», т. е. гибридизация в обход полового скрещивания, когда в качестве родительских клеток используются протопласты - соматические клетки, лишенные клеточной стенки. Растения-регенераты, возникающие in vitro из гибридных клеток, называются соматическими гибридами.

Протопласт является идеальным реципиентом для чужеродной ДНК, которая часто представляет собой плазмиды. Такая трансформация, обеспечивая проникновение и последующую экспрессию этой ДНК, может приводить к образованию генетически модифицированных растений. Таким образом, выделение, культивирование, слияние протопластов и перенос в них клеточных органелл, отдельных хромосом, ДНК позволит генетикам и селекционерам расширить разнообразие получаемых гибридных растений (рис. 36).

Успешное выделение протопластов зависит от многих факторов: типа ткани (лист, семядоля, корень, пыльцевые зерна, каллусная ткань, клеточная суспензия), вида растения и сорта, физиологического состояния растения, состава ферментов, их качества, рН среды и вида осмотика.

В нативной клетке протопласт прижат к клеточной стенке давлением, создаваемым центральной вакуолью, или тургорным давлением. Через клеточную стенку проходят протоплазматические тяжи - плазмодесмы, соединяющие цитоплазму данной клетки с цитоплазмой всех соседних клеток. Клеточная стенка с протопластом составляет единый структурно-функциональный комплекс. Чтобы не повредить содержимое клетки при растворении клеточной стенки, клетку подвергают плазмолизу. В качестве осмотика используются сахароза, маннит, сорбит. Под действием гипертонических растворов этих веществ клетка обезвоживается, протопласт сжимается и отстает от целлюлозно-пектиновой оболочки. Кроме того, высокое осмотическое давление среды выделения протопластов предохраняет их от осмотического шока, поскольку протопласты осмотически нестабильны (рис. 37). Иногда, если клетка вытянутая, протопласт при плазмолизе разбивается на части. В этом случае часть, в которую не попало ядро, называется цитопластом, это безъядерный субпротопласт.

Blog

Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» методические указания

Содержание