Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» опорный конспект
| Вид материала | Конспект |
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 828.3kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: ст преподаватель, 451.34kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 200 г. Автор: канд техн, 983.06kb.
- Директор Инженерной Академии д вет н., профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 433.94kb.
- Директор Инженерной Академии Докт вет наук, профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 1007.64kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преподаватель Чернетченко, 370.81kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: д т. н.,профессор Никифоров, 453.83kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп., магистр Плевако, 410.07kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: преп. Жумагулов, 428.14kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп. Харченко, 566.59kb.
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ИННОВАЦИОННЫЙ ЕВРАЗИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
ОПОРНЫй КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ
по дисциплине «Биотехнология растений»
для студентов специальности
050701 «Биотехнология»
очной формы обучения
ПАВЛОДАР 2009 год
УТВЕРЖДЕНО
Директор Инженерной Академии
Док. вет. наук, проф. _________ Е.Б. Никитин
«___» _______________ 2009 г.
Автор: преподаватель И.В. Тимофеева
Кафедра «Прикладная биотехнология»
ОПОРНЫЙ КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ
по дисциплине «Биотехнология растений»
для студентов специальности 050701 «Биотехнология»
очной формы обучения
на базе общего среднего образования
Разработан на основании Государственного общеобязательного стандарта высшего образования ГОСО РК 3.08.076-2004, типовой учебной программы по дисциплине «Биотехнология растений» специальности 050701 «Биотехнология» (г. Астана, 2005г.) и рабочей программы по дисциплине «Биотехнология растений» (2008г.).
Рассмотрен на заседании кафедры «Прикладная биотехнология»
Протокол № ___ от _________ 2008 г.
Зам. зав. кафедрой «Прикладная биотехнология»
Канд. техн. наук, профессор _______________ М.С. Омаров
Утвержден на заседании научно-методического совета Инженерной Академии и рекомендована к изданию
Протокол № ____ от __________2008г.
Председатель НМС факультета
очного обучения
Инженерной академии
Канд. техн. наук, профессор ______________ Е.К. Ордабаев
Согласовано:
Начальник ИМО ______________ Н.М. Ушакова
Тематический план лекций.
| № Лекции | Тема лекции | Количество часов |
| 1 | Вводная лекция. Культивирование клеток и тканей растений. | 2 |
| 2 | Использование сомаклональной изменчивости для улучшения сельскохозяйственных культур. | 4 |
| 3 | Индукция гаплоидов в культуре ткани и их значение в селекции. | 4 |
| 4 | Использование метода культуры ткани для размножения нежизнеспособных гибридов. | 4 |
| 5 | Клональное микроразмножение и оздоровление растений. | 4 |
| 6 | Криосохранение генофонда. | 4 |
| 7 | Генная инженерия в растениеводстве. | 4 |
| 8 | Клеточная селекция. | 4 |
| Итого | | 30 |
Лекция 1. Вводная лекция. Культивирование клеток и тканей растений.
Биотехнология – современная отрасль деятельности человека, основанная на использовании наук о природе и технических знаний для производства с помощью биосистем полезных продуктов.
В буквальном смысле слова биотехнология – это «биологическая технология», то есть применение фундаментальных биологических знаний в практической деятельности, направленной на производство лекарственных препаратов, ферментов, белков, красителей, ароматических веществ, витаминов и целого ряда биологически активных соединений. Кроме того, речь идёт об использовании биотехнологических методов в селекции и конструировании принципиально новых организмов, ранее не существовавших в природе.
Успешное развитие биотехнологии стало возможным благодаря многочисленным открытиям в биохимии, генетике, биологии клетки и молекулярной биологии, и, в первую очередь, на установлении структуры и функции определённых ферментов, их использовании в иммобилизованной форме в разнообразных производственных процессах, а также на том, что был открыт способ модификации ДНК и перенесения её из одних организмов в другие.
Развитие биотехнологии коснулось и растений, хотя и позднее. Для широкомасштабного производства клонов растений используются меристемы, а культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ, как самых обычных (алкалоиды и другие вторичные метаболиты), так и экзотических (идиолиты).
В 1937 году Готере с успехом культивировал недифференцированную ткань моркови. Полученный при этом каллус, отделенный от родительского растения, фрагментировали и получали растительный гормон роста – ауксин.
Позднее были получены культуры из отдельных растительных клеток, из которых были выделены протопласты. Слияние протопластов позволяет увеличивать число и разнообразие гибридов без применения полового размножения.
В лабораториях обнаружили способность изолированных клеток некоторых видов растений закаляться. Так, если клетки без закалки еле переносят температуру —20° С, то с закалкой способны выдержать и —35° С, а клетки сибирской яблони с закалкой терпят мороз ниже 50° С. Вот только клетки теплолюбивого лимона никаким закалкам не поддаются. Появилась возможность отбора клеток с большой морозостойкостью из каллуса пшеницы и ели.
Изолированные клетки сохраняют способность синтезировать вещества, присущие ей in vivo, то есть в теле живого организма, — витамины, гормоны, алкалоиды, кумарины, стероиды и так далее. Это заинтересовало биологов с точки зрения утилизации этих веществ для промышленности.
В лабораториях обнаружена еще одна способность клеток: отдели одну от других или посади ее на питательную среду поодаль от сородичей, и она наотрез откажется делиться и размножаться. Экспериментаторы, естественно, предполагают, что «телепатия» клеток имеет химическую природу, однако выделить и рассмотреть «в лицо» виновника «телепатии» до сих пор не удалось. Прямо не вещество, а привидение - очень уж мала его концентрация. Киевскому соратнику Р. Г. Бутенко —Ю. Ю. Глебе все же удалось заставить клетку, «страдающую» от одиночества, делиться в мельчайшей капельке питательной среды.
Чем дольше занималась лаборатория Р. Г. Бутенко культурой клеток, тем больше интересных явлений открывалось перед ее сотрудниками. Ну, хотя бы то, что клетки каллуса, имеющие единственного предка — одну прапрапра... (и так далее) клетку, оказываются через несколько поколений генетически различными. Может быть, изучив это явление, мы обнаружим, что предком обезьяны и человека был прозаический кольчатый червь.
Изменения, наблюдаемые в изолированной культуре, могут возникать вследствие мутаций специфических генов и хромосомных перестроек. Частота, тип и стабильность изменчивости зависят от генотипа исходного растения и физиолого-биохимического состояния («настроения») клетки. Высказано предположение, что условия изолированной культуры приводят к глубокой клеточной дестабилизации. Широкий спектр вариантов, образующихся из культивируемого материала, является отражением дестабилизации, за которой следуют действие отбора и вторичные наследственные изменения в популяции клеток.
Наблюдаемая изменчивость имеет большое значение при применении культуры клеток и тканей для улучшения сельскохозяйственных культур.
Воздействие мутагенами - веществами или радиацией, вызывающими наследственные изменения, увеличивает частоту измененных клеток, а использование селективных условий (например, повышенного инфекционного фона) создает предпосылки для размножения только измененных в нужном человеку направлении клеток. Однако многие исследователи, памятуя, вероятно, строки стихотворения Федора Тютчева («Природа — сфинкс. И тем она верней своим искусом губит человека...»), отказываются от использования мутагенов, чтобы избежать добавочных нежелательных мутаций. Тем более что мутантных клеточных линий возникает вполне достаточно и без их вмешательства.
В клетках каллуса часто меняется и число хромосом. Каллус растения гаплопаппус, например, через два года оказался состоящим на 95 процентов из полиплоидных (содержащих в ядре более двух геномов) клеток с числом наборов основного (базисного) числа хромосом, равным восьми и более. В США получены полиплоидные формы табака из клеток каллуса, культивируемых вне организма, отличающиеся рядом хозяйственно ценных признаков. Выход полиплоидных форм оказался настолько значительным, что этот метод рекомендован для экспериментального получения полиплоидов. Такие же результаты получены у лимона и клевера ползучего.
Да и вообще регенерировавшиеся из каллуса растения часто отличаются от своих родителей числом хромосом. Генетически идентичное воспроизведение генотипов через дифференциацию в культуре каллуса в настоящее время можно осуществить у сравнительно немногих видов.
Для селекции генетическая изменчивость клеток каллуса может представить определенный интерес. На основе регенерации в культуре тканей и органов растений получены высокопродуктивные формы подсолнечника. К сожалению, у таких важнейших сельскохозяйственных культур, как зерновые и бобовые, активировать морфогенез на питательных средах пока удается редко, но есть успехи при работе и с этими «непокорными» культурами.
На питательных средах при высокой интенсивности освещения ныне выращивают растения-гаплоиды из пыльцевых зерен. У них вдвое меньше хромосом, чем в обычных соматических клетках стеблей, листвы и корня родительского растения. Из них при удвоении хромосом путем обработки колхицином или закисью азота под давлением (есть и иные пути удвоения) получают дигаплоиды (или, допустим, тетрагаплоиды, если основной набор учетверен). Они гомозиготны, то есть обеспечивают проявление свойственных им признаков устойчиво на протяжении многих поколений. У них, как говорят генетики, не выщепляются новые признаки, если, конечно, не появляются мутации - внезапные новые наследственные признаки. Гомозиготные линии нередко используют в селекции на гетерозис - достоверное повышение продуктивности, качества или иного показателя против родительских форм, вовлеченных в гибридизацию.
Используют гаплоиды и иначе. В Китае с помощью культуры пыльников выведены короткостебельные, скороспелые и высокоурожайные сорта риса. Применение в этой стране питательных сред, включающих картофельный экстракт, привело к ранее недостижимому — получению гаплоидов у ржи, что открыло новые возможности в селекции этой перекрестноопыляющейся культуры. Получены интересные результаты у ячменя, перца, мака, люцерны, винограда, тополя, яблони и масличного рапса. У последней культуры, проведенной через культуру пыльников, несколько уменьшили и надеются уменьшить еще более содержание вредных гликозидных соединений. Всего в Китае к 1984 году из пыльцевых зерен выращено около 40 видов растений. Изучение популяций пшеницы, риса, кукурузы и табака из пыльников показало, что около 90 процентов удвоенных гаплоидов является генетически однородными, хотя у 10 процентов все же отмечена нестабильность числа хромосом и их структуры.
В России эффективный способ получения пшеницы из пыльцы в культуре пыльников разработан саратовскими учеными В. М. Сухановым, В. С. Тырновым и Н. Н. Салтыковой.
Самое интересное, что иногда и гибридизацию удается провести в чашках Петри, пробирках, вообще в каких-либо сосудах, в которые помещают изолированную от растения семяпочку. На нее наносят пыльцу, преодолевая таким образом самонесовместимость — отказ растения дать семена, если его пытаются оплодотворить собственной пыльцой.
В пробирке случается порой преодолеть несовместимость довольно отдаленных видов, и даже родов растений. Однако бывает и так, что скрестить растения, относящиеся к двум разным видам или родам, удается, но полученные от гибридизации семена не желают прорастать — сказывается несовместимость, допустим, зародыша с эндоспермом. Это обычное явление при скрещивании пшеницы и ржи (есть, однако, и другие факторы, препятствующие прорастанию). В таких случаях с успехом прибегают к отделению зародыша от эндосперма на ранних этапах развития зерновки и помещению зародыша на искусственную питательную среду, состоящую из многих компонентов.
При выращивании молодых эмбрионов добились завязывания жизнеспособных семян у межродовых гибридов - ячмень X рожь, элимус X пшеница, трипсакум X кукуруза; томат культурный X томат перуанский, чина пурпурная X чина членистая, лядвенец тонкий X лядвенец топяной, донник желтый X донник белый, фасоль обыкновенная X фасоль остролистная (тепарн), клевер сходный X клевер гибридный (розовый), слива североамериканская X слива персидская. М. Ф.Терновский с сотрудниками получил межвидовой гибрид табака с новыми свойствами устойчивости благодаря культуре на искусственной питательной среде каллусов из неспособных к прорастанию гибридных семян. Таким же путем получены нормальные гибриды первого поколения от скрещивания диплоидных и тетраплоидных форм райграса.
И, наконец, еще одно важное достоинство использования питательных сред. В пробирке удается слить воедино соматические клетки разных видов. Для этого, правда, их приходится беззастенчиво «раздевать» — освобождать от оболочки с помощью специальных ферментов. После этой процедуры мы имеем дело уже не с клеткой, а с протопластом. Протопласты двух видов кидают в один протопласт - гетерокариот, который через некоторое время обзаводится новой «одежкой». Так удается объединять даже животные клетки с растительными, например клетку табака с обнаженной клеткой дрозофилы. Надо сказать, что такие клетки, хотя и пытаются делиться, но впустую. К делению способны пока лишь слитые клетки видов в пределах одного рода, изредка - различных родов и семейств. Но как знать! Со временем будет преодолена и эта несовместимость, и селекционеры получат гибриды, которые им и во сне не снились.
К настоящему времени удалось совместить протопласты и получить соматические гибриды картофеля и томата, правда, с мизерным урожаем плодов и клубней. А вот соматическая гибридизация устойчивых к болезням и вредителям диких диплоидных видов картофеля (2х) с культурными диплоидными (2х) может представить практический интерес: 2х + 2х = 4х - это как раз оптимальный уровень плоидности у картофеля.
Неожиданны результаты канадца К. Н. Као, который получил гетерокариотические (с совмещенными ядрами) клетки из слившихся протопластов сои и табака сизого (табачного дерева), способные к делению, и линии клеток сои и табака с синхронным делением хромосом.
При использовании культуры клеток и тканей удается быстро размножить новый сорт, если культуру в производстве размножают вегетативно, или линию для производства гибридных семян у овощных, декоративных и других возделываемых растении. Чаще всего размножают (клонируют) верхушки побегов (такое размножение не совсем точно называют культурой меристемы - ведь, кроме последней, в процесс включаются и другие элементы) и латеральную (боковую) меристему - образовательную, интенсивно делящуюся ткань. Возрастает использование культур тканей для клонирования соцветий, цветков, боковых почек, листьев и корней, культуры каллуса и в отдельных случаях культуры клеток. У спаржи для размножения наиболее пригодны верхушки побегов, у пасленовых и краснокочанной капусты - кусочки (экспланты) листа, у цветной капусты и нарцисса - частички соцветий, у лилейных, ирисовых (касатиковых) и амариллисовых - экспланты из луковиц, клубней, ризомов (коротких мясистых корневищ), листьев, соцветий и семяпочек, у птицемлечника - экспланты из стебля, листьев, завязи, чашелистиков и даже луковичной чешуи, у глоксинии - высечки из листьев и цветоножек, у лука порея - кусочки луковицы, у герани при получении диплоидных растений - экспланты пыльников.
Наиболее экономически выгодно размножение в культуре тканей селекционных сортов цветов: орхидей, агав, бегоний, хризантем, цикламена, драцены, ириса, лилий, нарцисса, флокса и других.
Новой областью применения клонирования в стерильной среде верхушек побегов и других эксплантов стало размножение пород кустарников, плодовых культур и ананаса.
Из каллуса от зубчиков чеснока получили безвирусные растения. Экономически оправдано размножение методом стерильной культуры гетерозисных гибридных семян овощных и декоративных культур.
Культура тканей растений, главным образом верхушек побегов (меристем), играет очень важную роль в освобождении семенного материала от вирусов. Цветоводы первыми обнаружили, что растения, выращенные не из клубней или луковиц, а из делящихся клеток, помещенных в питательную среду, вирусными болезнями, как правило, не поражены и дают здоровое вегетативное потомство клубней и луковиц. Этот прием взяли на вооружение и картофелеводы-семеноводы.
Получение свободных или, вернее, почти свободных от вирусов растений - обычный прием первичного семеноводства некоторых сельскохозяйственных культур: картофеля, клевера, люцерны и хмеля, овощных (хрена, ревеня, шампиньона, цветной капусты), плодовых культур (малины, красной и черной смородины, яблони, сливы), а также декоративных растений (хризантемы, гвоздики, пеларгонии, фрезии, цимбидиума, гортензии, нарцисса, лилии, гиацинта, ириса, тюльпана, гладиолуса).
Кроме того, оказалось, что клетки растений, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении, что расширяет возможность получения специфических гормонов, ферментов, алкалоидов и других веществ.
Лекция 2. Использование сомаклональной изменчивости для улучшения сельскохозяйственных культур.
Индуцированный мутагенез с использованием химических и физических агентов применяют в селекции растений давно, этим путем получено в мире около 1000 сортов сельскохозяйственных культур.
Успехи мутационной селекции ограничиваются высокой частотой вредных мутаций, крупных хромосомных перестроек, появлением у мутантов мозаицизма, что делает трудным получение стабильных селекционных линий.
Развитие методов регенерации растении в культуре ин витро и открытие сомаклональной изменчивости создают новые возможности получения индуцированных мутантов.
Сомаклоны- регенераты растений, полученные из соматических клеток и обладающие определенными отличиями от исходных форм.
Сомаклональная вариабельность- размах колебаний в различии признаков у растений, регенерированных из культивируемых соматических клеток.
Соматическая изменчивость- это генетическая изменчивость, образующаяся в процессе искусственного культивирования тканей. В 1961 г. получены первые данные, свидетельствующие о нестабильности культур тканей. В отдельных случаях 15- 20% регенерированных растений отличается по тем или иным свойствам от исходных форм.
Характер сомаклональной изменчивости
Соматическая изменчивость была выявлена на кариотипическом, морфологическом, биохимическом и молекулярном уровнях. В различных типах клеток обнаружены полиплоидные и анеуплоидные изменения, хромосомные аберрации, нарушения митоза (многополюсные веретена, отстающие хромосомы, фрагменты и асимметричные хроматидные перестройки).
Каллусные клоны, полученные из отдельных диплоидных клеток, имеют диплоидный, тетраплоидный и анеуплоидный наборы хромосом. Обнаружение больших и малых делеций сопровождается потерей сателлитов, транслокациями, центрическими слияниями и присутствием анафазных мостов, которые свидетельствуют о хромосомных разрывах. Методом дифференциального окрашивания хромосом выявлены специфические структурные изменения.
Способность повышать уровень генетических изменений и даже возможное появление новых генов имеет большое биологическое значение, так как обеспечивает новые экспериментальные подходы в селекции растений.
Использование сомаклональных вариантов может ускорить в 2 раза процесс создания нового сорта. Возможны появление сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые трудно соединить в одном генотипе традиционным селекционным путем, например, скороспелость и длиннозерность риса или скороспелость риса и устойчивость к пониженным температурам.
Сомаклональная изменчивость имеет ненаправленный характер, как и в случае индуцированного мутагенеза. Однако на этапе регенерации растений значительное число вредных изменении отбраковывается. Наблюдаются вариации признаков как с простым, так и со сложным генетическим определением.
Так, у картофеля выделяли сомаклоны с изменениями формы куста, окраски, сроков завязывания клубней, требований к фотопериоду, устойчивости к болезням; у табака и томатов- с изменением формы, окраски цветков, плодов и листьев, габитуса куста, сроков созревания плодов, мужской стерильности и др.
Среди регенерантов мягкой пшеницы обнаружены наследуемые изменения высоты, числа зерен в колосе, массы зерна с колоса, содержания белков и ряда ферментов.
Генетический анализ показывает, что во многих случаях генетической основой сомаклональной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы генов доминантного, полудоминантного либо рецессивного характера в ядерном, пластидпом или митохондриальном геномах.
Фепотипические изменения, полученные в культуре клеток, могут быть также результатом нарушения функционирования определенных регуляторных механизмов в условиях культуры. Некоторые из этих изменений могут передаваться через митоз и проявляться в дочерних клетках, однако они обычно не проявляются в регенерированных растениях или в их половом потомстве. Генетические изменения отмечены также среди регенерантов, полученных из гамет (гаметоклоналъная изменчивость).
Необходимо отметить, что сомаклональная изменчивость является серьезной помехой при размножении ценных генотипов и длительном их хранении, когда требуется получать полную идентичность регенерированных клонов. Поэтому важной задачей как для повышения, так и снижения сомаклональной изменчивости является изучение факторов, индуцирующих вариабельность.
Факторы, вызывающие сомаклональную изменчивость
Генотип растения имеет большое влияние на широту изменчивости, образующейся в ходе культивирования. Среди зерновых сомаклональная изменчивость наблюдается наиболее часто у кукурузы, реже у ячменя, тритикале, пшеницы.
Значение имеет вид культуры, сорт и линия.
Так, например, в США линии кукурузы различались в 4 раза по частоте сомаклонов среди регенерантов.
Уровень сомаклональной изменчивости зависит от источника экспланта: верхушки побегов, основания листьев, черешки, узловые части стебля, цветочные почки, незрелые семяпочки, семядоли, пыльники, дигаплоидные семена. Культура меристем обычно проявляет значительно меньшую изменчивость, чем суспензионная культура клеток протопластов или недифференцированный каллус.
Уровень изменчивости повышается также при длительном культивировании ткани, при развитии регенерантов посредством органогенеза, а не эмбриогенеза.
Возможна мутагенная активность среды культивирования, особенно регуляторов роста. Так, показана роль фитогормона 6-бензил-аденина в увеличении частоты соматических мутаций.
Наконец, хотя большей частью сомаклональная изменчивость встречается в процессе культивирования ткани, нельзя исключить вклада предшествующей изменчивости в виде соматических мутаций в клетках донорного экспланта.
Вариабельность культивируемых клеток может быть усилена обработкой мутагенами (азид натрия, антибиотики, ультрафиолетовые лучи).
Использование сомаклональной изменчивости в селекции растений
Важное преимущество сомаклональной изменчивости заключается в создании дополнительной генетической изменчивости уже адаптированных ценных сельскохозяйственных сортов без гибридизации.
1. Выделение сомаклонов без отбора ин витро
В результате отбора сомаклонов с желаемыми признаками среди регенерантов Ро или их потомков были получены томаты с повышенным количеством сухих веществ, томаты и рис с мужской стерильностью, высокоурожайный рис, раннеспелая кукуруза, устойчивые к низким температурам и болезням пшеница, сахарный тростник, картофель, сельдерей, новые линии декоративных культур, малосемянный сорт сладкого перца Бель Свит (9 семян на плод вместо 330), масличная пальма с повышенной устойчивостью к фитопатогенам и повышенным на 20-30% количеством масла. В Австралии из культивируемых ин витро клеточных клонов вырастили красные камедные деревья, способные расти на засоленных почвах. Предполагают, что они будут выкачивать воду и тем самым понижать уровень грунтовых вод. Это приводит к снижению засоленности поверхностных слоев почвы в результате переноса минеральных солей в более глубокие слои с потоками дождевой воды.
2.Выделение сомаклонов с отбором ин витро
Использовании селективных сред при создании сомаклональных мутантов значительно экономит время и площадь: т.к. в одной чашке Петри размещается не менее 2 млн. отдельных клеток- родоначальников клонов, а затем и растений-регенерантов, что по своей генетической значимости эквивалентно использованию 33 га земельной площади.
Сомаклональные мутанты могут быть отобраны в культуре ин витро, по устойчивости к патотоксинам, гербицидам, к окружающим и внутренним стрессам, таким как теплоустойчивость или устойчивость к алюминию.
Важную роль при этом играет правильный выбор селективного агента. Для выделения форм, устойчивых к грибным болезням, в питательную среду вводят очищенный токсин гриба или культуральную жидкость, на которой развивался патоген. Из выживших клеток получают регенераты. Таким образом получены сомаклоны картофеля, устойчивые к фузариозу.
При селекции на устойчивость к гербицидам в питательную среду добавляют данный гербицид. Ткани проростков кукурузы в течение 4-6 месяцев культивировали (с .интервалом в 2-4 недели) на среде, содержащей гербициды группы имидозолинов, вызывающих 20%-ное ингибирование роста. В результате регенерации получены две устойчивые линии, имеющие доминантный ген, понижающий устойчивость к этим гербицидам в 300 раз.
Для выявления солеустойчивых, засухоустойчивых сомаклонов в питательную среду вводят хлорид натрия, пролин, полиэтиленгликоль. Абсцизовая кислота может быть использована и качестве агента для отбора ин витро растении, устойчивых к высокой температуре и засухе. В качестве селективных факторов для селекции клеток с повышенной способностью к синтезу незаменимых аминокислот используются аномальные аналоги незаменимых аминокислот. Использование сомаклональных вариантов ускоряет создание новых сортов.
В Институте физиологии растений и генетики Украины путем селекции на устойчивость к аналогам метионина получены регенеранты из ряда клеточных линий люцерны, характеризующиеся повышенным (на 30%) содержанием метионина; получены клеточные линии люцерны, табака и картофеля, резистентные к повышенному содержанию солей; отобраны клеточные линии и растения, у которых наблюдается сверхсинтез пролина, являющегося естественным протектором при стрессовых воздействиях и повышающего устойчивость растений к засолению и засухе.
Исследования но получению клеточных линий зерновых и бобовых, устойчивых к натрию и алюминию, ведут во ВНИИСХБ; пшениц, устойчивых к засолению,- в НИИСХ Юго-Востока. Исследования по отбору на устойчивость к гербицидам системного действия проводятся в Институте общей генетики АН СССР.
Во ВНИИСХБ методом клеточной селекции на устойчивость к токсинам получены растения картофеля с повышенной устойчивостью к фитофторе. В ВИЗР на основе клеточной селекции по устойчивости к фузариевой кислоте отобраны исходные формы клевера и люцерны, устойчивые к фузариозу.
Преимущества и недостатки метода
Таким образом, использование сомаклональной изменчивости имеет следующие преимущества:
1) это богатый источник генетической вариабельности (15-20% регенерантов отличаются от исходных форм);
2) технология клеточной селекции относительно проста по сравнению с технологией генной инженерии;
3) все более совершенствуются методы регенерации ин витро, значит, все большее число видов растений становится доступным для этой технологии;
4) использование сомаклонов не ограничивается законодательными рамками в отличие от использования растений, полученных методами генной инженерии.
Основной недостаток данного метода связан прежде всего с созданием селективных условий для клеточной селекции- не хватает знаний механизмов устойчивости к стрессам, ключевых реакций, определяющих адаптации. Кроме того, механизмы адаптации клетки и целого организма к стрессам могут быть различными и, наконец, такие признаки, как урожайность, сроки цветения и созревания, высота растения, интенсивность фотосинтеза и продуктивность, количество запасных белков семян, не проявляются на клеточном уровне. Сомаклональная изменчивость по этим признакам может быть полезной только в том случае, если она сопровождается эффективной оценкой целых растений.
Лекция 3. Индукция гаплоидов в культуре ткани и их значение в селекции.
Использование гаплоидов в селекции
1. Гаплоидные растения, т.е. растения, в клетках которых содержится половинный набор хромосом, широко используются в качестве посредников для получения гомозиготных изогенных линий, образуемых удвоением числа хромосом, из которых в дальнейшем получают гетерозисные гибриды. Изогенные линии на основе удвоенных гаплоидов можно создавать в течение года, тогда как традиционный метод инбридинга требует для этого 4-6 лет.
2. У перекрестноопыляющихся растений в результате удвоения числа хромосом гаплоидов получают чистые линии, имеющие самостоятельную ценность.
Так, получены линии кукурузы, отличающиеся высокой стабильностью, пониженной инбредной депрессией, значительной общей и специфической комбинационной способностью.
3. Гаплоидные клетки и растения позволяют легче обнаружить рецессивные мутации. После использования мутагенеза определяют в гаплоидах рецессивные мутации и затем получают стабильные линии с ценными мутантными признаками.
4. В гаплоидных клетках и растениях гораздо быстрее обнаруживаются не только рецессивные мутации, но и редкие рекомбинации генов, а также экспрессия введенного извне генетического материала, которые в обычных диплоидных растениях проявляются только во втором поколении при расщеплении. Это позволяет в 2-3 раза ускорить процесс создания сорта.
Это свойство используют для получения новых гаплоидов для селекции путем переиода гаплоидов в культуру гаплоидных протопластов и клеток и последующего использования мутагенеза, генноинжеперных манипуляций и клеточной селекции. После регенерации и удвоения числа хромосом гаплоиды с. ценными свойствами превращают в фертльное гомозиготное диплоидное растение.
5. В результате гибридизации гаплоидов с диплоидными видами получают:
а. моногаплоиды, в которых происходит утрата некоторых хромосом, что используется в моносомном генетическом анализе
б. гетерозисные триплоидные формы.
6. Гаплоиды используются для получения карликовых и других необычных форм декоративных растений.
7. Гаплопдпя применяется также и при отдаленной гибридизации.
Например, культурный картофель, являющийся тетраплоидом- 2п=48, плохо скрещивается с дикими диплоидными видами. После отбора диплоидные гибридные формы вновь переводят на тетраплоидный уровень.
Способы получения гаплоидов
В природе гаплоиды возникают из мужских или женских половых клеток, прошедших через редукционное деление мейоз в результате апогамии, гиногенеза или андрогенеза.
Редуцированная апогамия- возникновение зародыша из синергид или (реже) из антипод.
Гиногенез (женский партеногенез) происходит, когда при опылении спермий, войдя в яйцеклетку, дегенерируют до слияния с ней. В результате стимулированная к делению, но неоплодотворенная яйцеклетка формирует гаплоидный зародыш.
Андрогенез (мужской партеногенез) возникает, когда спермии, попадая в яйцеклетку, вызывает дегенерацию ее ядра. Ядро же спермия начинает делиться вместе с цитоплазмой яйцеклетки, в результате развивается гаплоидный зародыш с отцовским набором хромосом.
С появлением экспериментальной гаплоидии ин витро источником получения гаплоидных тканей стали либо микроспоры, либо клетки зародышевого мешка при культивировании соответственно пыльников или семяпочек на питательных средах.
В настоящее время применяют следующие методы индуцирования гаплоидов:
1. Псевдогамия- развитие гаплоидного зародыша после опыления инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки.
2. Метод гаплопродюсера- селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше.
3. Индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы.