Geum.ru

Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» опорный конспект

Вид материалаКонспект

Содержание


Лекция 6. Криосохранение генофонда.
Лекция 7. Генная инженерия в растениеводстве.
Подобный материал:
1   2   3   4   5

Лекция 6. Криосохранение генофонда.

Важным вкладом в селекцию растений стала технология сохранения генофонда в культуре ин витро. Цель создания коллекций и банков клеток растений- обеспечение селекционера нужным для его работы генотипом. В любое время сохраняются редкие и исчезающие виды, сохраняются растения, размножающиеся как вегетативно, так и семенами (это особенно важно для поддержания гетерозисных гибридов, линий с ЦМС), таким образом сохраняются те уникальные генотипы, свойства которых были бы потеряны при половом размножении. Сохраняются также линии клеток и каллусов, синтезирующих ценные продукты вторичного метаболизма.

Криосохранение (от греч. «криос»- мороз) буквально означает хранение в замороженном состоянии. На практике это обычно хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (-79°С), в морозильниках с ультранизкой температурой (-80°С и ниже), в парах (-140°С) или непосредственно в жидком азоте ( -196°С).

8.1. Криосохранение пыльцы и семян

Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Для этого подсушенную пыльцу помещают в запечатанные пластмассовые ампулы и переносят в жидкий азот. Криобанк пыльцы делает возможным скрещивание сортов растений, различающихся по времени цветения или же имеющих пыльцу с коротким периодом фертильности.

Успехи криоконсервиронания семян в значительной мере зависят от степени их влажности, верхней границей которой является 10-15%. Это связано с тем, что в достаточно сухих семенах вода является связанной, не способной замерзать. Как только при намачивании и набухании семян появляется свободная вода, в них образуется лед при замораживании, который приводит к механическим повреждениям клеток и к их гибели.

Установлено, что большинство видов растений имеют семена, которые можно легко высушить до низкой влажности (10-13% и ниже) без существенной потери их всхожести. Такие семена могут быть сохранены в жидком азоте путем прямого погружения после предварительного высушивания в вакууме. Однако существует нижний предел допустимой влажности 4-7%. При высушивании семян ниже 4° наблюдаются повреждения, связанные с аутоокислением липидов в меристематических зонах зародыша.

Относительно скорости оттаивания семян после их замораживания в литературе имеются расхождения. Так, для сои некоторые авторы считают более безопасным медленное оттаивание на воздухе при 0°С; другие же получили 80%-ное выживание семян сои при быстром погружении их в жидкий азот с последующим быстрым оттаиванием.

Быстрое оттаивание семян с хорошей степенью выживаемости было применено для 13 сортов картофеля после трехлетнего хранения в жидком азоте.

В настоящее время при глубинном замораживании семян используют методику японских исследователей Сакан и Ноширо (1975), которые рекомендуют высушивать семена до 8-15%, упаковывая их в пакеты из фольги или ампулы с плотными крышками, которые в дальнейшем погружаются прямо в жидкий азот, и после хранения постепенно размораживать их на воздухе. Однако семена других растений (такие тропические культуры, как кофе, какао, гевея) не могут прорастать, если их влажность снижается ниже 31-12% (в зависимости от вида). Какие-либо рекомендации по их криоконсервированию отсутствуют, однако в этом случае может оказаться полезным предыдущий опыт криоконсервирования. Так, Г.А. Самыгину (1960) удалось сохранить всхожесть ржи и пшеницы на уровне 71 % после замораживания в жидком азоте и даже жидком водороде (-253°С) набухших семян, содержащих 70-80% воды. Успех был достигнут благодаря постепенному еженедельному ступенчатому замораживанию семян путем понижения температуры в холодильных шкафах до -60°С с последующим их погружением в жидкий азот. Оттаивание проводилось в этих же шкафах с периодическим повышением температуры через каждые два дня. Предполагается, что при небольших скоростях охлаждения происходит перераспределение воды внутри семян и лёд образуется в эндосперме, вызывая обезвоженность зародыша и предотвращая тем самым его механические повреждения.

Помимо глубинного замораживания семян, возможно их хранение и при небольших пониженных температурах. В настоящее время имеются конкретные рекомендации для хранения семян. Так, например, для семян картофеля оптимальной пониженной температурой хранения является -14°С, для семян сорго -12°С. Однако такое хранение вряд ли целесообразно. Это связано с тем, что биохимические процессы при таких температурах не полностью подавлены; кроме того хранение семян в таких условиях требует дополнительной зашиты от высокой влажности и дополнительных мер предотвращения часто случающихся отказов механических систем охлаждения.

8.2. Криоконсервирование верхушечных, меристем клеток растений

Безусловно, хранение семян растений путем глубинного замораживания- наиболее простой и дешевый способ сохранения генетических ресурсов. Но многие растения размножаются только вегетативным путем (черенками, отводками, клубнями). На сегодняшний день для вегетативно размножающихся растений наилучшим способом сохранения их генофонда является криоконсервирование верхушечных меристем побегов. Следует отметить, что данный способ может оказаться единственно пригодным для долгосрочного хранения растений с так называемыми «неподдающимися» семенами, так как обладает большим преимуществом по сравнению с другими объектами, культивируемыми в данных условиях. Это объясняется прежде всего тем, что меристемы после криосохранения сразу развиваются в целое растение, т.е. в данном случае нет необходимости проводить дополнительные процедуры, связанные с регенерацией растений. Клетки меристемных растений всегда однородны по плоидности, и регенерируемые из них растения соответствуют исходному генотипу, этим обеспечивается большая генетическая стабильность. Кроме того, меристемные клетки растений очень мелкие, почти невакуолизированы, а связи с этим они намного легче переносят глубокое замораживание и оттаивание. Подвергая криоконсервированию меристемы, можно не только сохранить данный генотип, но и получить впоследствии путем микроклонального размножения необходимое количество растений.

Значительно сложнее стоит проблема криоконсервации клеток растений. Наибольшие трудности здесь связаны с процессом замораживания, так как клетки растении имеют свою специфику. Они обладают большими размерами, сильной вакуолизацией, обилием воды и чрезвычайной шпротой и пластичностью их метаболизма, поскольку находятся в значительно более изменчивых условиях, чем, например, клетки животных. В этой связи выживаемость клеток растений даже в лучших (редких) случаях не превышает 69-70%.

В течение многих лет для сохранения исходных культур использовалось постоянное выращивание растений при оптимальных условиях. Но при этом существует риск возникновения сомаклональной изменчивости, загрязнения чужеродным генетическим материалом, случайной утери собственного генетического материала. К тому же для поддержания культуры тканей обычно требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через каждые 2-4 недели, что оказывается довольно трудоемким и дорогостоящим процессом. В настоящее время существуют два основных подхода к хранению культур замедленный рост коллекции и криосохранение.

а) Замедленный рост коллекции. Для замедления роста большинства культур необходимы факторы, ограничивающие рост. Наиболее часто используется снижение температуры культивирования. Поместив коллекции в условия низких температур (1-10°С в зависимости от холодостойкости вида растений), период без пересадок можно удлинить до 6-24 месяцев.

Рост растений можно задержать добавлением к питательной среде соединений, способных замедлять рост (ретарданты). Они могут оказать осмотическое действие (маннит) или быть веществами гормональной природы (абсцизовая кислота). Еще один способ- изменение состава атмосферного воздуха, с которым соприкасается культура, чаще всего снижение в нем содержания кислорода (гипоксия), например, выращивание в атмосфере, состоящей из смеси азота (90%) и кислорода (10%). Кроме того, задержку роста можно вызвать, снижая атмосферное давление до 0,014 мм ртутного столба или комбинируя пониженное давление и гипоксию.

Обычное время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Таким образом, если полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма.

б) Криосохранение. Главное преимущество хранения при очень низких температурах состоит в значительном замедлении и даже остановке метаболизма и биологического разрушения. Благодаря этому более совершенному и широко используемому способу сохраняются мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогенезу клетки: меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльца, семена, в том числе не выносящие обезвоживания, причем в течение любого срока. Кроме того, хорошо отлаженное криосохранение менее трудоемко, чем поддержание и хранение коллекции. К настоящему времени разработаны условия криосохранення культур клеток примерно 30 видов растений.

Успех низкотемпературного криоконсервирования зависит от целого ряда факторов: генетических и морфологических особенностей клеток, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротектора, режима охлаждения и условий оттаивания, способности к закаливанию и уровня проницаемости криопротектора.

Рассмотрим процессы, происходящие в клетке при охлаждении. Точка замерзания чистой воды 0°С, но ее можно охладить до более низких температур (вплоть до -38°С), при этом льда не образуется. Такая вода называется переохлажденной. Снизить точку замерзания можно добавлением растворяющихся веществ, например хлорида натрия, или криопротекторов (глицерин, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль).

При охлаждении водного раствора происходит постепенное образование чистого льда. В результате постепенного удаления из раствора воды (за счет перехода ее в лед) все растворенное вещества концентрируются в оставшемся растворе, вследствие чего заметно снижается его температура замерзания. По мере дальнейшего охлаждения вода из раствора будет продолжать удаляться до тех пор, пока, наконец, не будет достигнута температура плавления, при которой и этот концентрированный раствор твердеет.

Как клеточная стенка, так и плазматическая мембрана выступают в качестве барьеров для роста льда. Так как цитоплазма клетки по отношению к внеклеточной среде изначально гипертонична, то лед сначала образуется вне клетки. Внеклеточные растворы становятся концентрированными, и осмотический градиент через мембрану клетки меняет свое направление. В результате клетки начинают терять воду, постепенно обезвоживаясь, а растворы внутри клетки становятся более концентрированными, что является одной из главных причин повреждения клеток в процессе охлаждения (осмотический стресс). Другой причиной является образование внутриклеточного льда. Опасен рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0,1 мкм), чьи грани разрушают мембраны. Полностью рост и перестройка кристаллов льда прекращается в чистой воде только при температуре около -140°С. Вот почему длительное уверенное хранение возможно только при низких температурах. Таким образом, повреждении клеток при замораживании и последующем оттаивании зависит, с одной стороны, от образования льда внутри них (механический стресс), а с другой- от их обезвоживания (осмотический стресс).

При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, что приводит к обезвоживанию и повреждениям клеток до того, как будет достигнута температура замерзания цитоплазмы. Быстрое охлаждение вызывает более раннее замораживание клеток изнутри и меньшее обезвоживание; повреждения клеток вызываются при этом образующимися внутри клеток кристаллами льда.

В криосохранении используют метод двуступенчатого охлаждения, который заключается в предварительном замораживании клеток быстрым охлаждением до температуры ниже нуля и кратковременном выдерживании их при этой температуре перед быстрым охлаждением до температуры хранения. Прерывание быстрого охлаждения и выдерживание в течение определенного времени при температуре, выше критической, вызывает сжатие клеток, в результате чего клетки становятся способными пережить охлаждение и оттаивание. Высокие концентрации внеклеточных растворов, создающиеся во время периода предварительного охлаждения, по-видимому, обеспечивают сжатие, достаточное для защиты клеток от повреждения. Оптимальная температура и продолжительность периода предварительного замораживания зависят от типа клеток и связаны с кинетикой движения воды через клеточную мембрану. На этом этапе в среду добавляют криопротекторы- вещества, которые уменьшают повреждения клеток от осмотического и механического стресса при замораживании и оттаивании, изменяют проницаемость клеток и температуру замерзания. Это вызвано снижением количества образовавшегося льда и, следовательно, концентрации других растворенных веществ. Криопротекторами являются либо проникающие в клетки вещества- диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, либо не проникающие высокомолекулярные- поливинил, пиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Наиболее часто используют ДМСО- или один, или с добавлением сахарозы, глицерина.

Большое значение для успеха криосохранения имеет режим замораживания на этапе от 0° до -40°С, который может быть медленным (со скоростью 0,5-1°С в минуту) или сверхбыстрым (от 50° и более чем 1000°С в минуту до непосредственного погружения в жидкий азот объектов размером до 0,5 мм).

Хотя для наиболее мелких и устойчивых клеток (например, моркови) допустимы скорости замораживания 1-4°С/мин, для более крупных и вакуолизированных, к которым относится подавляющее большинство культивируемых ин витро клеток растений, рекомендуемая скорость 0,5°С/мин, а для самых больших и клеток апексов еще меньшие скорости.

Криоконсервация культур растений во многих случаях начинается с этапа специальной подготовки, хотя существуют культуры, которые достаточно просто брать для замораживания в начале или в середине экспоненциальной фазы роста, когда они обогащены меристемоидными клетками в результате интенсивных делений. Один из способов предварительного культивирования- добавление в среду маннита или сорбита в концентрации 2-6% на период от нескольких суток до 2-3 пассажей. Такой способ уменьшал размер клеток и, что важнее, их вакуолей.

При втором способе предкультивирования используют аминокислоты и среди них в первую очередь пролин, чье значение для связывания воды в клетке широко известно. Его концентрацию постепенно поднимали для ряда клеток до 1 М (11,5%) на срок до 4 суток (большой период предкультивирования приводил к дегенеративным изменениям в клетках). Кроме пролина используют низкие концентрации аланина, серина и аспарагина в течение 4-6 суток; наилучшие результаты были получены с аспарагином. В результате в клетках уменьшается количество зерен крахмала и их размеры и увеличивается (примерно в 2 раза) содержание сахаров. Повышается и выживание клеток после оттаивания.

Третий способ предварительного культивирования применяли вначале только для апексов побегов- плотных организованных структур без межклетников, размером около 500 мкм.

Проникновение во внутренние клетки апексов даже легкопроникающего ДМСО и их образование затруднены. ДМСО добавляли в концентрации от 2,5 до 10% (чаще 5% на срок до 48 часов).

Четвертый способ осуществляется в условиях искусственного закаливания к холоду, он применим только к зимующим растениям умеренного климата. Суть закаливания сводится к имитации естественного осеннего процесса подготовки растений к периоду зимнего покоя. При работе с клеточными суспензионными или каллусными культурами обычно их (так же как и растения) или сразу помещают в условия с температурой от 2 до 5°С на срок от 1 до 6 недель, или сначала в течение нескольких суток выдерживают при температуре 8-10°С. Более эффективно закаливание в присутствии сахарозы (до 12-15%).

После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирование (даже в течение 5 мин. при 100 g) повреждает многие растительные клетки, то применяют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые устанавливают в сосуд со льдом. Длительность осаждения 15-30 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными и устойчивыми клетками оседают последними. После осаждения надосадочную жидкость отсасывают.

Замороженные культуры необходимо хранить при низкой температуре, по крайней мере, при -100°С. На практике для этого удобнее всего использовать жидкий азот (-196°) или его пары (-150°С).

При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит повторное образование льда, оказывающее повреждающее действие. Поэтому предпочтительнее использовать быстрое оттаивание. Для этого ампулы встряхивают в воде с температурой 40°, иногда 60°С. Но как только начинает исчезать последний кристаллик льда в ампуле, ее переносят в сосуд со льдом.

Отмывание от криопротектора применяется только в случае использования веществ, токсичных для данных клеток. Содержимое ампулы разбавляют в 3-4 приема с 15-мипутпыми интервалами большим объемом холодной питательной среды или 3-15%-ной сахарозы. Повышенная концентрация сахарозы полезна для замедления деплазмолиза, если криопротектор вызвал плазмолиз. Затем клетки отстаивают, а надосадочную жидкость заменяют питательной средой, объем которой приблизительно равен исходному объему суспензии.Возобновление роста культур требует 2-3 недель.


Лекция 7. Генная инженерия в растениеводстве.

Предмет генной инженерии- осуществление трансгеноза (переноса генов). Трансгеноз осуществляется в четыре этапа:

1) получение нужного гена;

2) его встраивание в вектор (молекулы ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в клетку, где они реплицируются);

3) введение гена в составе вектора в организм;

4) идентификация клеток, которые приобрели желаемый ген.

1. Получение генов

Получить нужный ген можно:

а) выделением его из ДНК;

б) путем химико-ферментативного синтеза;

в) воссозданием нл основе информационной РНК с помощью фермента РНК-завн-симон ДНК-иолимеразы (ревертазы).

а) Выделение гена из ДНК. Изолированную ДНК разрезают на фрагменты с помощью ферментов- рестрикционных эпдонуклеаз (рестриктаз), которые узнают определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-6 нуклеотидных пар). К настоящему времени известно более 400 рестриктаз, которые узнают 85 вариантов различных последовательностей.

Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне- образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, так что образуется ступенька- одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК., полученных действием одной и той же рестриктазы, то в силу комплементарности концевых последовательностей они легко взаимодействуют и при участии фермента лигазы сшиваются:

Однако часто трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену (кроме нужного участка включаются липкие последовательности или, наоборот, отщепляются части нуклеотдной последовательности гена, в результате чего ген становится функционально неполноценным).

б) Химико-ферментативный синтез гена. Синтезируются короткие (8-16-звенные) одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), которые затем сшиваются между собой с помощью фермента лигазы с образованием двухценочечных полинуклеотидов. Для .химико-ферментативного синтеза генов необходима информация о первичной структуре: соответствующего белка. Таким способом уже получены гены соматостатина и инсулина.

в) Синтез гена на основе выделенной из клетки информационной РНК. Это наиболее распространенный метод.. Обратная траискриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной иРНК. Полученную одноцепочечпую ДНК, называемую комплементарной ДНК (кДНК), используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы. Таким способом в 1979 г. был получен ген гормона роста человека (соматотропин).

2. Введение гена в вектор

Векторы- это кольцевые молекулы ДНК, способные к самостоятельной репликации. Вектор с включенным в него геном образует так называемую рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется ин витро. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, такие же, как концы вводимого гена. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой, и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы.

В качестве векторов наибольшее применение в генетическом инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды кишечной палочки, а в генной инженерии растений плазмиды бактерий Агробактериум тумефациенс и Агробакгериум ризогенез. Агробактериум тумефациенс содержит так называемые Ti-плазмиды, Т-участок ДНК плазмиды может встраиваться в геном растений (крестоцветные, злаки). Ti-плазмиды содержат три гена (онкогены), два из которых кодируют стадии синтеза ауксина, а третий отвечает за синтез цитокинина. В отличие от роста нормальных клеток, который регулируется поступлением ауксинов и цитокининов, рост клеток, содержащих Т-участок Ti-плазмиды, бесконтролен, что приводит к образованию наростов-опухолей. Плазмиды могут быть «обезоружены» вырезанием у них онкогенов. Вставка в Т-участок гена, кодирующего нужный нам белок, ведет к превращению Ti-плазмид в очень полезный вектор для трансгеноза. Агробактериум ризогенез содержит Ri-плазмиды которые можно использовать аналогичным образом.

3. Перенос гена в клетки организма-реципиента

Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации (если гены встроены в геном вируса путем трансформации). Трансформация- это перенос свободной ДНК в реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходит рекомбинация и встраивание однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента. Для проведения трансформации растений необходимо получение изолированных протопластов. Совместное культивирование изолированных протопластов с бактериями Агробактериум (или рода Ризобиум) ведет к эффективной трасформации растительных клеток. Максимальное количество трансгенных растений получено путем переноса с помощью Ti-плазмиды. Однако наряду с векторными разрабатываются методы прямого переноса генов в растения. К их числу относятся: микроинъекции ДНК, электропорация, упаковка в липосомы, биологическая баллистика.

Для осуществления микроиньекций применяются иглы из электродных трубок с внешним диаметром 2 мкм и внутренним 1,25 мкм. Примерный объем инъекции в каждый протопласт составляет 10-5 мл. Стеклянная микроигла с помощью микроманипулятора вводится в клетку (на 2-5-й день культивирования протопластов) и из нее выдавливается капля буферного раствора, содержащего 9-1 мкг/мкл ДНК. Эффективность трансформации при этом 10-20%.

Электропорация- введение ДНК в электрическое поле высокого напряжения, которое обратимо усиливает проницаемость биомембран, благодаря чему молекулы ДНК поглощаются протопластами сразу же или после электрического шока, преимущественно через поры мембран.

Для защиты генов, вводимых в протопласты растений, используются липосомы- сферические тельца, оболочка которых состоит из фосфолипидов. Липосомы способны сливаться непосредственно с мембраной клетки или поглощаться ей в результате эндоцитоза. Упаковка в липосомы защищает ДНК от нуклеаз.

Новый способ введения генов в растения- биологическая, баллистика (биолистика) состоит в бомбардировке клеток в специальном устройстве при небольшом вакууме вольфрамовыми микрочастицами размером около 4 мкм, покрытыми нуклеиновыми кислотами, которые, попадая в клетки вместе с этими частицами при обстреле, успешно размножаются в них.

4. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели нужный нам ген

После манипуляций по переносу генов, как правило, лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток, включивших нужный нам ген, проводят в две стадии.

Первая стадия- отбор клеток, несущих соответствующий нектор, послуживший для трансплантации гена. Такой отбор проводится по генетическим маркерам, которыми заранее метят вектор- чаще всего это маркерные гены устойчивости к какому-либо антибиотику, что помогает обнаружить клетки, включившие вектор, при их высеве на среду с этим антибиотиком.

Вторая стадия- поиск клеток, несущих не только вектор, но и нужный нам ген. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

а) определение нуклеотидной последовательности ДНК клеток, предположительно содержащих искомый ген;

б) гибридизация выделенной из клеток ДНК со специально меченым зондом, в качестве которого используют или интересующий нас ген или соответствующую ему иРНК. Для этого предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноценочечным же ДНК- или РНК-зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:

а) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок- продукт работы пересаженного гена, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном;

б) использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген;

в) иммунологическое обнаружение с помощью готовых антител к белку, им закодированному.