Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» опорный конспект
| Вид материала | Конспект |
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 828.3kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: ст преподаватель, 451.34kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 200 г. Автор: канд техн, 983.06kb.
- Директор Инженерной Академии д вет н., профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 433.94kb.
- Директор Инженерной Академии Докт вет наук, профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 1007.64kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преподаватель Чернетченко, 370.81kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: д т. н.,профессор Никифоров, 453.83kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп., магистр Плевако, 410.07kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: преп. Жумагулов, 428.14kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп. Харченко, 566.59kb.
Возникновение гаплоидов в процессе псевдогамии
При некоторых комбинациях межвидовой гибридизации зародыш и семя развиваются без оплодотворения женской гаметы. Псевдогамия может также иметь место при опылении облученной пыльцой того же вида или при скрещивании видов с разным уровнем плоидности.
Скрещивания, приводящие к гипогепезу- развитию гаплоидного зародыша из неоплодотворенной яйцеклетки- после несовместимого опыления, использовались для картофеля, люцерны, пшеницы.
Исследование процессов, происходящих при культивировании неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы, показало, что гиногенетические зародыши развиваются в данном случае либо из яйцеклетки, либо из антипод. Синергиды обычно разрушаются. Частота образования гаплоидов- 2 растения на 1000 культивируемых семяпочек. Гомозиготные дигаплоидные растения были получены при обработке колхицином и изучены в полевых условиях.
Метод гаплопродюсера («бульбозум»- метод)
Установлено явление селективной элиминации (утраты) хромосом одного из родителей во время раннего развития зародыша при отдаленной гибридизации некоторых видов. Этот метод нашел широкое применение в селекционной работе с ячменем, при скрещивании с диким видом Hordeum bulbosum. В первых делениях зиготы, возникшей в результате оплодотворения яйцеклетки Hordeum vulgare пыльцой Hordeum bulbosum вследствие генетической несовместимости происходит элиминация отцовских хромосом и начинает развиваться гаплоидный зародыш. Предполагают, что в геноме H. bulbosum отсутствуют механизмы присоединении хромосом к нитям митотического веретена. Однако часто нормальное развитие зародыша на материнском растении тормозится, его приходится изолировать и выращивать на питательной среде в культуре ин внтро. Затем гаплоидные проростки обрабатывают колхицином для удвоения числа хромосом и получения гомозиготных изогенных линий. Этим методом в Канаде созданы сорта ячменя Минго и Родео. Во Всесоюзном селекционно-генетическом институте на основе гаплоидной селекции и метода гаплопродюсера созданы за короткий срок (за 4-5 лет вместо 8-10) сорта ячменя Исток и Одесский 5, отличающиеся высокой продуктивностью и повышенной устойчивостью к полеганию, засухе, пыльной и твердой головне. В НПО «Элита Поволжья» этим методом создано более 700 засухоустойчивых линий ячменя, в НИИСХ Юго-Востока- многочисленные линии яровой пшеницы и ячменя, в НИИКХ линии картофеля, используемые в селекционном процессе, во ВНИИСХБ- перспективные андрогенетические линии пшеницы.
Индуцированный андрогенез
Процессы изолирования пыльников и их культивирование приводят к блокированию развития части спор по нормальному гаметофитному пути и переходу их к аномальному развитию, в результате которого возникают гаплоидные растения. В настоящее время таким способом получено более 200 видов растений. Они преимущественно относятся к семействам пасленовых, злаковых, крестоцветных. Наибольших успехов в этом достигли селекционеры Китая, где созданы новые высокоурожайные и устойчивые сорта риса и пшеницы, уже занимающие большие посевные площади: рис- 170000 га и пшеница- 70000 га. В нашей стране также созданы тысячи исходных линий риса, табака, картофеля. Методы, с помощью которых индуцируют деление и регенерацию незрелой пыльцы, можно разделить на методы культуры пыльников, при которых пыльца содержится внутри соматических тканей пыльника, и методы культуры пыльцы, при которых эти соматические ткани удаляются.
а) Культура пыльников. В настоящее время большое значение приобретает метод получения гаплоидных растений при культивировании пыльников, в которых часть микроспор продуцирует эмбриоиды или каллусную ткань. Из эмбриоидов при определенных условиях культивирования сразу же удается получить проростки с гаплоидным числом хромосом. Это так называемый прямой андрогенез, когда эмбриоиды (и соответственно регеперанты) развиваются непосредственно из микроспор (например, у табака).
В большинстве же случаев формированию регенерантов предшествует фаза каллусогенеза (как это происходит, например, у риса)- косвенный андрогенез. В случае возникновения из микроспор каллусной ткани процесс получения гаплоидов оказывается более сложным, поскольку вначале необходимо индуцировать стеблевой органогенез, что не всегда удается, а затем укоренить образовавшиеся побеги. Кроме того, каллусная ткань, как уже отмечалось выше, не обладает генетической стабильностью и поэтому полученные из нее регенераты не всегда сохраняют ценные признаки исходных растений и нередко оказываются к тому же частично диплоидными. В связи с этим для генетических и селекционных целей первый путь получения гаплоидов следует считать наиболее перспективным, хотя возникновение из микроспор жизнеспособных эмбриоидов- явление сравнительно редкое.
Сам метод получения гаплоидов в культуре пыльников сводится к следующему. Исходные объекты, т.е. пыльники, изолируют в асептических условиях из предварительно простерилизованных бутонов. Их сразу же помещают на питательные среды, состав которых приходится подбирать для каждого объекта эмпирически. Очень важно, чтобы к моменту изоляции пыльников микроспоры в них достигли оптимальной для перехода к эмбриогенезу фазы развития.
В подавляющем большинстве случаев оптимальный срок изолирования пыльников- стадия так называемых средних или поздних микроспор. На этой стадии микроспоры, освободившись из тетрад, вакуолизируются и готовятся к первому митозу. Однако оптимум для разных видов может варьировать от стадии тетрад до двуядерного пыльцевого зерна. Например, у крестоцветных оптимальной является ранняя одноядерная стадия развития пыльцы.
В результате отклонения микроспоры от нормального развития она может перейти к прямому апдрогенезу, при котором гаплоидный зародыш возникает прямо из микроспоры (вегетативной или генеративной клетки) без каллусообразования, или начать формировать каллус.
В первом случае (прямой путь или андрогенез) микроспора делится и образуется 40-50-клеточный проэмбрио. Зародыш в глубулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные стадиям развития нормального зародыша.
При образовании каллусной ткани (непрямой путь) пыльца также делится, но клетки, возникающие в результате деления, быстро увеличиваются в размере и, разрывая оболочки пыльцевого зерна, образуют массу каллуса.
При культивировании пыльников риса, пшеницы, ячменя обычно из микроспор образуется каллус, для табака свойствен андрогенез.
Появление и эмбриоидов, и каллусов из микроспор одного пыльцевого гнезда наблюдается у картофеля, томатов, хлопчатника.
Важную роль в судьбе микроспор играют ткани изолированного пыльника (эндотеции и тапетум).
Характеристика полученных при культивировании пыльников растений зависит от того, возникли ли они путем прямого андрогенеза или при регенерации из каллусных тканей.
При андрогенезе можно ожидать получения истинных гаплоидов. Из каллуса могут быть получены ди-, три-, тетра- и т.д. эуплоиды и анеуплоиды, а также другие генетические изменения, в таком случае образуются растения, называемые гаметоклональными вариантами.
Полиплоидия клеток может достигаться благодаря эндоредупликации хромосом и слиянию ядер, а также в результате формирования микроспор с нередуцированным числом хромосом. Одно из проявлений гаметоклональной изменчивости- появление растений-альбиносов в культуре пыльников злаков. Количество их и соотношение с нормальными зелеными растениями зависят от вида растения, стадии развития пыльцы в момент изолирования пыльников, условий культивирования.
Выход гаплоидов зависит от видовых и сортовых особенностей растений.
Так, очень существенно различаются между собой отдельные виды пшеницы, табака, сорта картофеля. У целого ряда видов до сих пор не удалось найти условии, при которых бы из микроспор формировались жизнеспособные гаплоидные проростки.
Наиболее часто используются следующие условия выращивания растений-доноров: короткий день (8 часов), высокая интенсивность освещения (20000 лк), пониженная температура (12°С).
Возраст растения-донора, положение цветочной почки на растении, время, прошедшее с начала зацветания также влияют на выход гаплоидов.
Рекомендуется изолировать бутоны с растений, находящихся в начале периода цветения.
Имеет значение и состав питательных сред. Так, при культивировании пыльников картофеля положительное влияние на переход микроспор к эмбриогенезу оказывало увеличение содержания сахарозы до 6%.
Для культур пыльников других растений оптимальной оказалась более низкая концентрация сахарозы (2-3%), причем замена сахарозы глюкозой или другими сахарами приводила к гибели пыльцы.
В качестве стимулирующего условия в большинстве работ используют предварительную обработку изолированных пыльников низкой положительной температурой (4-6°C). Время обработки варьируется для разных видов от 2 до 28 суток.
Вероятно, под влиянием холода подавляются процессы нормальной дифференцировки пыльцы, что приводит к увеличению ее эмбриогенного потенциала
Аналогичное действие на эмбриогенез оказывало предварительное центрифугирование бутонов или изолированных пыльников. По-видимому, такое стрессовое воздействие также блокирует нормальный ход спорогенеза пыльника, а это способствует переходу микроспор на путь эмбриогенеза или каллусогенеза. Выход эмбриоидов в культуре пыльцы повышался в тех случаях, когда пыльники культивировали после предварительной холодовой обработки бутонов еще некоторое время на питательной среде, после чего пыльцу изолировали и высевали на питательную среду.
Культуре пыльников присущи два основных недостатка.
Во-первых, растения в таких культурах развиваются не только из пыльцы, но и из различных клеток стенки пыльника, поэтому они могут различаться по уровню плоидности.
Во-вторых, стенка пыльника может продуцировать некоторые вещества, ингибирующие процесс пыльцевого эмбриогенеза. В связи с этим изучалась возможность получения гаплоидов непосредственно из изолированной пыльцы.
б). Культура пыльцы. Несмотря на теоретическую привлекательность, этот метод применим лишь для отдельных видов (морковь, табак). Однако даже у них конечный выход растений-регенерантов на один пыльник обычно ниже, чем из микроспор, развивающихся внутри пыльника. А у злаков микроспоры невозможно отделить от других тканей пыльника без резкого снижения их жизнеспособности, а значит, выживаемости и развития в культуре.
Разработаны различные методы отделения пыльцы от соматических тканей пыльника.
1. Спонтанное высвобождение. У многих видов, если применяют правильно подобранное сочетание стадии развития пыльцы, предварительной обработки и условий инкубирования, пыльники при культивировании раскрываются, и при использовании жидкой среды пыльца, свободная от соматической ткани, всплывает.
2. Гомогенизация и фильтрация. Пыльники, культивируемые в течение 3-4 дней, осторожно разрушают в жидкой среде. Затем полученную суспензию фильтруют и центрифугируют. Удаляют надосадочную жидкость, промывают пыльцу и выращивают ее с изначальной плотностью 5*104 в 1 мл.
3. Метод разрезания. Стенки пыльника разрезают так, чтобы дать выход каллусам или зародышам, образовавшимся из микроспор.
При культивировании пыльцы используются два способа: первый- суспензия пыльцевых зерен помещается на поверхность фильтра, смоченного питательной средой и лежащего на пыльниках, которые играют роль «няньки»; второй- суспензию пыльцы наносят на плотную питательную среду с агаром.
Исследования показали, что частота образования эмбриоидов при культивировании изолированной пыльцы значительно меньше, чем при культивировании целых пыльников. Это указывает на большую роль тканей пыльника в индукции перехода микроспор к эмбриогенезу или образованию каллуса.
Таким образом, применение методов экспериментальной гаплондии значительно упрощает и в 2-3 раза сокращает процесс получения стабильных гибридов по сравнению с традиционными методами.
Из микроспор при культивировании пыльников ин витро получены гаплоиды нескольких сот видов и уже использованы при получении новых сортов ячменя, тритикале, табака, перспективных исходных форм картофеля и многих других сельскохозяйственных растении.
Лекция 4. Использование метода культуры ткани для размножения нежизнеспособных гибридов.
Требования к ускорению селекционного процесса и сокращению сроков создания новых сортов привели к сужению генотипической изменчивости и прогрессирующему процессу объединения генофонда. Стандартизация сортов, распространение их небольшого числа на больших площадях, ограничение генетического потенциала при внутривидовых скрещиваниях на устойчивость к болезням и вредителям, а также отсутствие в исходном материале резерва полезных генов по ряду хозяйственно ценных признаков в будущем может явиться одним из основных лимитирующих факторов в селекции.
В связи с этим возникает необходимость поисков новых методов расширения генетической изменчивости и создания новых доноров полезных свойств засухоустойчивости, холодостойкости, солевыносливости, устойчивости к болезням и вредителям и т.д.
Эти методы связаны с отдаленной гибридизацией. Однако при отдаленной гибридизации возникают определенные трудности, связанные с нескрещиваемостью исходных видов, непрорастанием гибридных семян, наконец, стерильностью получившихся гибридов. В решении этих проблем большое место отводится методам сельскохозяйственной биотехнологии.
Преодоление прогамной несовместимости.Оплодотворение ин витро.
Физиологическая несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе до оплодотворения, может зависеть от следующих причин:
1) генетически определенного несоответствия (или отсутствия) секрета рыльца пестика материнского растения и пыльцы отцовского, что тормозит рост пыльцевых трубок еще на рыльце пестика;
2) различий партнеров по длине столбика пестика и пыльцевой трубки (ге-теростилия);
3) блокирования роста трубки на разных этапах ее пути от рыльца пестика до пыльцевхода семяпочки вследствие тканевой несовместимости партнеров.
Способом преодоления несовместимости на этапе до оплодотворения (прогамной несовместимости) является оплодотворение ин витро или плацентарное оплодотворение.
Метод существует в двух вариантах.
1) по первому варианту столбик пестика материнского растения, кастрированного за 2 -3 дня по цветения, в стерильных условиях укорачивается или срезается полностью, а завязь помещается на питательную среду;
2) по второму- завязи вскрываются и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, готовыми к оплодотворению. В день цветения бутоны отцовского растения стерилизуют поверхностно, пыльники асептически извлекают, переносят в бюкс или чашку Петри, подсушивают до состояния высыпания пыльцы. Готовую пыльцу по первому варианту в стерильных условиях наносят на срез завязи, по второму- переносят на питательную среду вблизи плаценты с семяпочками или прямо на ткани плаценты. Оплодотворенные семяпочки в отличие от неоплодотворенных быстро увеличиваются в размерах. Часто при плацентарном оплодотворении зародыш не переходит и состояние покоя и проростки появляются здесь же ин витро, что ускоряет процесс получения гибридного растения. Плацентарное оплодотворение ин витро позволило преодолеть несовместимость при получении межвидовых гибридов табака.
Преодоление постгамной несовместимости. Эмбриокультура
Несовместимость таксономически отдаленных партнеров проявляется и на других этапах получения гибридов, она может быть физиологической или генетической природы. Несоответствие партнеров в этом случае наблюдается уже после оплодотворения, поэтому такая несовместимость называется постгамной. Остановки в развитии и росте гибридных зародышей часто имеют физиологические причины и связаны либо с несоответствием в темпах развития зародыша и эндосперма, либо с непригодностью (токсичностью) метаболитов тканей материнского растения для питания зародыша. В таких случаях культура изолированных семяпочек и зародышей на искусственных средах также может исправить положение.
Культура изолированных зародышей широко используется в нашей стране при гибридизации плодовых растений, в межвидовой гибридизации хлопчатника, лука, томатов, при межвидовых скрещиваниях ячменя с рожью и пшеницей. В некоторых случаях метод модифицируется введением промежуточного этапа получения гибридного каллуса и растений- регенерантов на его основе. Этот подход впервые в мире был использован в работе Терновского и др. (1972) для получения гибридных растении табака при межвидовом скрещивании. В результате этого скрещивания удавалось получать гибридные семена, но проростки гибли на стадии семядолей из-за отмирания первичного корня и остановки роста. Индукция образования каллусной ткани из семядолей и гипокотилей гибридных проростков, а затем и органогенеза в каллусах позволила получить сотни амфигаплоидных растений. Их колхицинирование восстановило фертильность, и от амфидиплоидов было получено второе поколение и произведены скрещивания с сортами культурного табака.
Гибридная каллусная ткань в настоящее время успешно используется не только для клонирования амфигаплоидных зародышей, но и для получения вариантных форм. Так, из одного исходного гибридного зародыша, возникшего при скрещивании ячменя и пшеницы, было получено более 100 регенерантов. У половины из них отмечены различия по морфологии и окраске колоса, длине остей и другим признакам, что дает основание считать их сомаклональными вариантами.
Культуры изолированных зародышей представляют большой интерес для селекционеров и, в частности, для садоводов, поскольку при этом выявляются следующие возможности:
1) получение гибридных зародышей, которые в условиях целостного организма не смогли бы выжить вследствие элиминирующего действия материнского растения;
2) выведение зародыша из состояния покоя, характерного для некоторых видов растений;
3) разработка тестов определения жизнеспособности семян;
4) исследование потребностей развивающегося зародыша в тех или иных питательных или физиологически активных веществах, а также других факторов.
В проведенных исследованиях выяснилось: чем в более раннюю фазу развития изолируется зародыш, тем трудное подобрать питательную среду, которая полностью бы заменяла комплекс веществ, поступающий к нему из эндосперма и тканей завязи. Так, зрелые или почти зрелые зародыши способны к росту на минеральных питательных средах с добавлением сахарозы. Менее равитые нуждаются, кроме того, в аминокислотах, витаминах и фитогормонах, причем состав и соотношение этих физиологически активных веществ для разных этапов эмбриогенеза различен. Наиболее сложный комплекс веществ необходим при изолировании еще недифференцированных зародышей вскоре после оплодотворения. Их удается культивировать ин витро только при введении в состав питательной среды кокосового молока, жидкого эндосперма каштана или грецкого ореха, которые только в отдельных случаях удавалось заменить искусственно составленным гормональным комплексом. Эти трудности с подбором питательных сред удается обойти путем культивирования семяпочек с кусочком ткани, к которой они прикреплены. Иногда на питательную среду помещают целиком кусочек завязи с семяпочками; в таких случаях удаётся довести до созревания двухклеточный предзародыш или даже зиготу.
Культура изолированных семяпочек и потерявших всхожесть семян является полезным методом сохранения важного для селекции материала при повреждении растений (патогены, экстремальные погодные условия). Такое применение было описано для риса, подсолнечника, картофеля. Вместе с тем эмбриокультура может быть использована для ускорения прохождения жизненного цикла растений- это может сократить, длительность селекционного процесса. Так, обнаружено, что время генерации озимой пшеницы можно сократить примерно на 40 дней, если 16-20-дневные изолированные зародыши прояровизировать ни витро. Кроме того, для ускорения селекционного процесса могут быть использованы индукция цветения в культурах верхушек побегов, прямое формирование цветочных почек на эксплантах пемеристематического происхождения.
Культура завязи нередко позволяет достичь желаемого результата даже в тех случаях, когда попытки культивирования зародышей и семяпочек оказались безуспешными. Благоприятное действие на культивируемые ткани оказывают, по-видимому, плацента и стенка завязи. Росту завязи ин витро способствует также сохранение чашечки. Предполагают, что определенные части цветка- чешуи, околоцветник, чашелистики- оказывают добавочное воздействие на культуру, переводя неорганические нитраты в аммоний, т.е. легко усваиваемую форму азота.
Потребности изолированной завязи в питательных веществах изменяются в зависимости от того, в какой момент времени она была перенесена в условия ин витро. Завязи, изолированные через несколько дней после опыления, достаточно хорошо растут на простой питательной среде, содержащей сахарозу и минеральные соли. Неопыленные завязи в культуре обычно не развиваются, хотя иногда удается достичь образования партенокарпических плодов. Судьба опыленных завязей в культуре определяется временем, когда была проведена инокуляция- на ранних этапах развития семяпочки, когда она содержит зиготу или ранний проэмбрио и ядерный эндосперм, или же на более поздних стадиях, когда проэмбрио еще не дифференцирован, но эндосперм уже хорошо развит. В первом случае наблюдаются многочисленные аномалии развития завязи, во втором- из семяпочек образуются зрелые нормальные семена.
Наконец, одна из перспективных технологий на основе культуры ткани- получение искусственных (синтетических) семян. Искусственные семена состоят из соматических зародышей, инкапсулированных в подходящем материале (например, альгинате натрия) и покрытых оболочкой для защиты капсулы от высыхания. Пока система искусственного семеноводства только разрабатывается, но ожидают, что в недалеком будущем она сможет конкурировать с традиционным семеноводством для быстрого размножения элитных растении, а также для размножения новых линий и сортов. Преимущество ее в том, что многие разновидности, полученные с помощью культуры клеток, не могут быть размножены семенами из-за мейотической нестабильности, которая ведет к потере желаемых качеств. Считают, что технология искусственных семян внесет значительный вклад и производство продукции в будущем.