Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» опорный конспект
| Вид материала | Конспект |
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 828.3kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: ст преподаватель, 451.34kb.
- Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 200 г. Автор: канд техн, 983.06kb.
- Директор Инженерной Академии д вет н., профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 433.94kb.
- Директор Инженерной Академии Докт вет наук, профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 1007.64kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преподаватель Чернетченко, 370.81kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: д т. н.,профессор Никифоров, 453.83kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп., магистр Плевако, 410.07kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: преп. Жумагулов, 428.14kb.
- Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп. Харченко, 566.59kb.
Лекция 5. Клональное микроразмножение и оздоровление растений.
Термин «клон» (от греческого- «отпрыск») был предложен Вэбером в 1903 г. для вегетативно размножаемых растений.
Клональное размножение- это использование техники ин витро для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному. Обязательным условием клонального микроразмножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах.
Этому условию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения.
Этапы и преимущества микроклонального размножения
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на несколько этапов:
1 Выбор растения-донора, изолирование и стерилизация эксплапта, создание условии для его роста на питательной среде ин витро.
2. Собственно размножение путем:
а) размножения чероз каллусную и суспензионную культуру;
б) индукции образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем, зачатками соцветий- без образования ими каллусной ткани;
в) стимуляции развития всех пазушных почек экспланта в результате подавления апикального доминирования как химическим путем, так и при микрочеренковании побегов.
3. Укоренение размножаемых побегов и адаптация пробирочных растений к условиям ин витро.
4. Выращивание извлеченных из культуральных сосудов растений в условиях теплицы в почве. Подготовка к реализации или высадке в поле.
Преимущества клоналыного микроразмножения растений:
1. Значительно более высокие коэффициенты размножения, достигающие миллиона растений в год, по сравнению с 5-100 растениями от одного, полученными обычными способами за этот срок.
2. Миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями, и позволяющая поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку.
3. Оздоровление посадочного материала oт нематод, грибов, бактерий и вирусов, вызывающих болезни растений.
4. Возможность создания нужного для селекционера количества копий уникальных генотипов (линий, гибридов, мутантов, трансгенных растений).
5. Возможность размножить и укоренить те растения, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычными способами, например, быстрое клональное размножение лучших экземпляров взрослых лесных деревьев, особенно хвойных. Таким образом, имеется реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных форм оздоровленных сортов, а также редких и исчезающих видов растении путем длительного хранения пробирочных растении при пониженной температуре.
Однако самой крупномасштабной областью применения клонального микроразмножения является быстрое размножение вновь созданных и уже существующих ценных хозяйственных сортов с целью получения массового оздоровленного посадочного материала, освобожденного от вирусной инфекции.
Вирусные болезни- причина потери от 10 до 50% урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативным способом.
К настоящему времени идентифицировано более 600 видов фитопатогенных вирусов, а по мере создания более совершенных методов диагностики обнаруживают все новые формы.
Причины роста вирусных заболевании связаны:
1. с появлением более агрессивных штаммов вирусов;
2. возделыванием ценных в хозяйственном отношении сортов, но имеющих низкую устойчивость к вирусам;
3. изменениями агротехники при интенсификации промышленного производства; возможностями современного транспорта и торговли;
4. с обменом семенным, посадочным и селекционным материалом. Благодаря этому вирусные заболевании могут легко и быстро перешагнуть не только границы отдельных сельскохозяйственных регионов, но и стран и континентов.
В большинстве случаев вирусные заболевания не вызывают полной гибели растений, а приводят к снижению урожая, иногда настолько значительному, что возделывание данной культуры становится нерентабельным. Так, например, при поражении овса вирусом желтой карликовости в некоторых районах США было зарегистрировано снижение урожайности на 63%. Урожайность овощного гороха, зараженного вирусом мозаики, падала на 89%. Потери урожая земляники могут составлять от 5 до 75%.
Помимо прямого снижения урожая вирусные заболевания значительно снижают и качество произведенной продукции.
Оздоровление растений от вирусной инфекции состоит из нескольких этапов:
1) диагностика заболевания;
2) поиск или создание исходного оздоровленного материала;
3) его размножение и предотвращение повторной инфекции.
Методы диагностики вирусных заболеваний
Методы диагностики вирусных заболеваний должны обладать высокой чувствительностью и достоверностью, быть высокопроизводительными при проведении анализов.
1. Визуальная диагностика.
Во многих случаях вывод о зараженности растений вирусами можно сделать уже по внешним симптомам- нарушениям роста, хлорозам, некрозам, мозаике листьев, а также изменениям, проявляющимся на стеблях, цветках, плодах, семенах и клубнях растения.
Метод визуальной диагностики прост, не требует специальных приборов, но предполагает определенный опыт и знания наблюдателя.
Основные недостатки метода- низкая специфичность положительных и неудовлетворительная достоверность отрицательных результатов. Т.К. симптомы, обусловленные различными вирусами, часто чрезвычайно сходны друг с другом. Сходные изменения могут вызвать изменения условий среды, недостаток или избыток отдельных элементов питания, неправильное внесение гербицидов, патогенные грибы и другие факторы.
В семеноводческой работе визуальная диагностика применяется как метод предварительной оценки зараженности материала: результаты данного метода нуждаются в проверке и уточнении другими способами.
2. Электронномикроскопическая диагностика. Обычно данный метод используют для идентификации вирусов при изучении болезней неизвестной этиологии или в тех случаях, когда другие методы не дают однозначного ответа.
Электронномикроскопическую диагностику используют для контроля при очистке вирусов в получении антигенов в процессе приготовления антисывороток, а также при получении растений-регенерантов, выращенных из верхушечных меристем.
Однако пропускная способность этого сложного и дорогостоящего метода невысока.
3. Индикаторная диагностика. Сущность метода заключается в перенесении предполагаемой вирусной инфекции на так называемые растения-индикаторы, которые способны реагировать на диагностируемый возбудитель определенными симптомами. Заражение растений осуществляется натиранием листьев соком исследуемого образца; в тех случаях, когда вирусы не передаются контактным путем, трансплантируют живую ткань исследуемого образца на растение-индикатор.
Эффективность индикаторной диагностики зависит от правильного выбора растения-индикатора, условий выращивания до и после заражения, выбора момента заражения. Метод довольно трудоемок и требует специальных площадей для выращивания растений-индикаторов в искусственных условиях.
4. Серологическая диагностика вирусов. Серологическая диагностика вирусных заболеваний основана на иммунитете теплокровных животных.
При введении фитопатогенных вирусов (антигенов) в организм животного образуются антитела, которые способны вступать в реакцию с вирусами.
Эта реакция специфична- антитела реагируют только с тем вирусом, который был введен в организм животного.
Выделяя антитела из крови животных, получают сыворотки, специфичные к тому или иному вирусу. Для диагностики вирусной инфекции смешивают сок пораженного растения с сывороткой, специфичной к какому-либо вирусу. При наличии в растении аналогичных вирусов в результате реакции «антиген-антитело» образуется хлопьевидный осадок. Для получения специфичных сывороток необходимо иметь высокоочищенные суспензии вирусов одного вида. Вирусы выделяют из инфицированных растений и ими иммунизируют теплокровных животных (кроликов, овец, лошадей).
5. Иммуноферментный анализ. Впервые метод был предложен для практической диагностики фитовирусов немецким исследователем А. Фоллером (1974 г.) под названием метода двойного наслоения антител (сэндвич-метод).
Данный метод основан на мечении антител ферментами, которые образуют с антителами достаточно прочные комплексы-конъюгаты; а также на адсорбирующей способности белковых частиц- иммуноглобулинов (антител) на поверхности органических полимеров, в частности на поверхности лунок, сделанных в полистероле.
Принцип метода заключается в следующем. В лунки полистерольных планшетов вносят специфические антитела, которые в течение определенного времени адсорбируются на поверхности лунок. Далее в эти же лунки вносят сок тестируемых растений. Если в тестируемом соке содержится вирус, он связывается с фиксированными на поверхности лунок антителами (первая иммунная реакция).
Затем на полученный фиксированный комплекс «антиген-антитело» наносят антитела, меченные ферментом, которые наслаиваются на антигены (вирусы растений)- (вторая иммунная реакция).
После добавления в лунки соответствующего ферментного субстрата в случае наличия вируса в тестируемом соке растения происходит цветная ферментная реакция. При этом интенсивность окраски или оптическая плотность продукта ферментативной реакции зависит от концентрации фермента, т.е. фиксированного комплекса «антиген-антитело».
Результаты анализа можно оценивать визуально или на специальных приборах- автоматических фотометрах.
Иммуноферментный анализ характеризуется исключительно высокой чувствительностью и надежностью полученных результатов, а также широкой автоматизацией работ при серийных анализах. Он используется как в семеноводстве отдельных культур, так и при решении эпифитологических проблем.
Так, например, именно благодаря этому методу впервые стало возможным определение вирусов растении в единичных переносчиках- тлях.
Создание оздоровленного материала
Визуально-серологический отбор основан на поиске и позитивном отборе здоровых форм растений.
Для оценки на заражение используют метод визуальной и серологической диагностики.
Визуально-серологический отбор не всегда позволяет выявить все зараженные растения, особенно первично инфицированные в год отбора, а также зараженные растения с низкой концентрацией вирусных частиц.
Поэтому отобранный материал подвергают в большинстве случаев дополнительной проверке.
Термотерапия. Термотерапию проводят двумя способами.
1. метод основан на кратковременном прогревании покоящихся частей растений-отводков, клубней, луковиц, черенков. У некоторых культур их можно прогревать до 56°С, не опасаясь необратимого повреждения тканей.
Обычно термообработку проводят в воде, нагретой до определенной температуры; продолжительность обработки варьирует от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от биологических особенностей вируса и растения-хозяина.
Режим тепловой обработки подбирается экспериментально для каждой комбинации «вирус-растение».
2. метод основан на прогревании активно растущих растений горячим воздухом. Растения выдерживают при температуре от 35 до 40°С в течение нескольких недель в климатических камерах с контролируемыми параметрами среды.
Этот способ гораздо результативнее первого и более распространен. Однако метод термотерапии все же не может гарантировать дотаточной надежности. Поэтому полученный после прогревания материал в течение некоторого времени необходимо тщательно проверять на наличие вирусной инфекции.
Культура меристем. Впервые использовать культуру меристем для создания исходного безвирусного материала из инфицированных растений предложил французский исследователь Ж. Морель в 1948 г.
В 1952 г. этим методом впервые были получены безвирусные растения георгина и картофеля. Таким образом, было практически продемонстрировано отсутствие вирусов в апикальной меристеме инфицированных растений. Это открытие быстро получило самое массовое практическое применение при производстве семенного картофеля, плодово-ягодных и декоративных растений.
Апикальная или верхушечная меристема- это небольшой участок (не более 0,1 мм) на верхушке стебля, состоящий из недифференцированных клеток, включает конус нарастания и первую пару листовых зачатков (примордиев).
Клетки апикальной меристемы постоянно делятся и практически не содержат вирусов.
В настоящее время существует несколько гипотез о причинах отсутствия вирусной инфекции в верхушечной меристеме.
Одни авторы объясняют это более медленным распространением вирусов от клетки к клетке, так как в зоне верхушечной меристемы отсутствует проводящая система. Эта гипотеза основывается на экспериментально полученных данных, подтверждающих, что рост верхушки (апикальной меристемы) происходит гораздо быстрее, чем продвижение вируса.
Другие исследователи объясняют отсутствие вирусов особым метаболическим состоянием клеток меристемы, исключающим возможность размножения в них вирусов: высокой концентрацией ауксинов, отсутствием необходимых для этого ферментов и других соединений. В ряде случаев отсутствие вирусной инфекции объясняется тем, что на пути продвижения вирусов в меристематическую зону имеются механические преграды, связанные со слишком малыми размерами плазмодесм.
Минимальный размер участка апикальной ткани, из которого можно вырастить целое растение, у большинства сельскохозяйственных растений не превышает 100-200 мк (0,1-0,2 мм).
Между размерами вычленяемых меристем и эффективностью их оздоровления установлена прямая зависимость.
Чем меньше размер меристемы, тем ниже выход регенерируемых из них растений, но и тем выше вероятность получения освобожденных от вирусной инфекции регенератов. Меристемы меньшего размера с трудом поддаются культивированию, и процесс регенерации у них идет намного хуже.
Выбирая размер меристемного экспланта, надо оценивать возможности получить максимальное число растений при максимальном проценте безвирусных.
Чем больше размер меристематического экспланта, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого, нормального пробирочного растения.
Размеры же, зоны, свободной от вирусных частиц, очень различны для различных вирусов, а также зависят от сорта и вида растений.
Так, при вычленении апикальной меристемы картофеля величиной 0,2 мм среди полученных растений только 10% были свободны от X-вируca, но 70% от У-вируса картофеля.
Одни биотехнологи предпочитают использовать предельно малый размер экспланта (0,075-0,1 мм) и разрабатывают оптимальные условия для получения нормального пробирочного растения.
Другие предпочитают сочетать термотерапию и культуру меристем (предварительная термотерапия исходных растений обеспечивает оздоровление от вирусов при использовании эксплантов 0,3-0,8 мм, но приводит к отставанию в росте и деформации органов).
Работы по вычленению верхушечных меристем проводят в стерильных условиях. Меристемы отделяют от растения под бинокулярным микроскопом и переносят на агаризованные питательные среды или на маленькие кусочки фильтровальной бумаги, погруженные в питательный раствор.
Для каждой культуры эмпирическим путем составлены свои питательные среды. По достижении растениями-регенерантами определенной степени развития их из стерильных условий переносят в почвенный грунт и доращивают в теплицах или климатических камерах.
Регенеранты необходимо тестировать на наличие вирусов. Выход оздоровленных растений от числа эксплантированных меристем обычно бывает невысоким, нередко составляет всего 20-30%.
Химиотерапия. Для освобождения растений от вирусной инфекции в ряде случаев используют химические вещества- ингибиторы вирусов, которыми обрабатывают ростки растений перед вычленением меристем или добавляют их в питательную среду.
В качестве ингибиторов вирусов используют регуляторы роста нафтилуксусную кислоту (НУК), гиббереллин, индолилмасляную кислоту (ИУК), а также панкреатическую рибонуклеазу и другие ферменты.
В питательную среду добавляют «ворозол» (синтетический рибаварин- аналог гуанознна-1-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксамида) в концентрации 40-200 мм, что увеличивает процент безвирусных меристемных растений до 80-100% при 0-41% в контроле.
Для повышения эффективности оздоровления исходного материала часто сочетают методы химиотерапии, термотерапии с методом верхушечных меристем.
В последнее время появилась возможность борьбы с вирусом томатов и огурцов в защищенном грунте с помощью вакцинации растений непатогенными вирусными штаммами, мутантами исходных патогенных.
Другой путь- получение непоражаемых вирусами сортов гибридизацией с устойчивыми дикими видами. С помощью генной инженерии созданы растения табака и томатов, устойчивые к ВТМ и вирусу мозаики люцерны. Однако о практическом использовании таких трансгенных растений говорить рано.
Пока же наиболее эффективным для создания безвирусного посадочного материала картофеля, винограда, плодовых, ягодных и других растении является способ культивирования меристем стебля или органов стеблевого происхождения, иногда дополненный термотерапией.
Микроклональное размножение
Получение растений, свободных от вирусной инфекции,- только первый шаг использования их в семеноводстве. Следующая важная задача- их ускоренное размножение. Кроме того сам по себе метод микроклонального размножения дает возможность получать в больших количествах растения у таких культур, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, а также быстро размножить уникальный генотип, например, новый сорт.
Метод позволяет поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку. Наконец, благодаря этому методу появилась реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных культур.
В настоящее время существует несколько подходов к клональному микроразмножению растений в культуре ин витро:
1) получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза;
2) индукция развития побегов непосредственно из ткани эксплантата;
3) пролиферация пазушных побегов.
Эти способы имеют различные коэффициенты размножения, различную степень надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм растений, а также различаются универсальностью и повторяемостью получаемых результатов.
1) Размножение растений через каллусную и суспензионную культуру наиболее перспективно, так как здесь можно добиться максимального коэффициента размножения.
В 1 см3 суспензионной культуры или каллусной ткани содержится огромное количество клеток, каждая из которых является потенциальным растением.
Данный метод имеет следующие недостатки:
1. При культивировании каллуса и индукции органогенеза в клетках могут произойти структурные изменения хромосом, например анеуплоидия или полиплоидия, что увеличивает вероятность получения измененных, по сравнению с исходными, форм.
2. В настоящее время для большинства видов растений не удается создать условия для соматического эмбриогенеза, особенно для суспензионной культуры.
Через каллусную культуру удается размножать хризантему, гвоздики, землянику и некоторые другие растения. В целом метод можно было бы признать весьма эффективным (особенно если учесть то обстоятельство, что при культивировании ин витро каллусные ткани освобождаются от возбудителей вирусных заболеваний), если бы удалось найти достаточно простои способ отбора растений-регенерантов с неизмененным в результате культивирования геномом.
2) Формирование адвентивных почек и побегов Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (например, в роде бегония), что используется для их размножения.
Условия культуры ин витро могут в сильной степени стимулировать этот процесс на цветной капусте.
Отмечена тенденция к развитию адвентивных побегов в присутствии повышенных концентраций цитокининов.
Главным преимуществом этого метода является сохранение при размножении всех признаков размножаемого образца. Однако полностью исключить возможность получения неоднородного потомства нельзя. Это связано с тем, что в тканях эксплантов могут встречаться клетки с измененным числом хромосом вследствие сомаклональной изменчивости.
И хотя вероятность появления растений-регеперантов из таких клеток очень мала, тем не менее ее нельзя не принимать во внимание, так как в условиях ин витро измененные формы могут неожиданно получить преимущество в развитии. Показана возможность размножения путем индукции побегов из ткани эксплантата таких культур, как цветная капуста, актинидия, земляника, некоторых цветочных культур.
3) Пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель впервые была отработана на землянике в начале 70-х годов. Снятие апикального доминирования может осуществляться двумя путями.
а) Получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на «однопочковые микрочеренки», которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения.
Теоретическая возможность такого способа составляет приблизительно 100 тыс.- 1 млн. побегов в год при условии, что за два месяца можно получить одни побег, дающий 10 «микрочеренков».
При работе с картофелем чаще всего пользуются черенкованием. Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на фрагменты размером 0,5-1,0 см, каждый из которых должен иметь листочек и пазушную почку.
Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения. При этом среда может быть как плотной (т.е. с агаром), так и жидкой. Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют.
Таким образом, из ограниченного числа «меристемных» растений за несколько месяцев можно получить большое количество безвирусного посадочного материала (за полгода- 30000). При этом за каждый цикл черенкования оно возрастает и 4-5 раз. А после получения из черенков необходимого количества растений ин витро их пересаживают в зимние или весенне-летние теплицы, пленочио-марлевые изоляторы или открытый грунт.
б) Второй путь- снятие апикального доминирования путем введения в питательную среду веществ с цитокининовой активностью, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам.
Экспланты на таких средах приобретают вид пучков маленьких побегов, каждый из которых может быть рекультивирован с тем же результатом. Теоретически, при условии получения 50 дополнительных почек в течение пассажа длительностью 2 месяца, возможность этого метода может составить до 15 млрд. почек или побегов в год от одного экспланта.
По мнению многих исследователей, способы размножения на основе снятия апикального доминирования имеют минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота появления мутантных форм (в расчете на число новообразований) здесь не превышает частоту появления таковых при размножении растения обычными методами. Данный способ получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высокой воспроизводимостью полученных результатов.
Возможно снятие апикального доминирования веществами с цитокининовой активностью. Клубни картофеля получают из растений, выращенных в полевых условиях.
Клубень режут на кусочки размером 2,5 см, обрабатывают гиберреловой кислотой и инкубируют для стимуляции образования побегов. Меристемные ткани изолируют и пересаживают на среду без регуляторов роста. В течение месяца побеги увеличиваются в размерах и развиваются придаточные корни. Перенос побегов на среду, содержащую цитокинины, приводит к развитию пазушных почек. Растения-регенеранты с хорошо развитыми побегами и корнями можно переносить в почву или, перенеся их на среду, содержащую бензиламинопурин (БАП), вызвать образование миниатюрных клубней.
4) Дальнейшее размножение полученных из меристем растений картофеля можно производить также путем клубнеобразования.
Как показали специальные исследования, для этого пригодны только черенки из нижней части укороченного побега.
При этом процесс клубнеобразования стимулируется сокращением длины дня до 8 часов в сутки, введением в состав питательной среды вместо сахарозы глюкозы в концентрации 3% и понижением температуры.
Такой индуктивный режим необходимо выдержать в течение 12 суток, а затем для доращивания образовавшихся клубней пробирочные растения оставляют в условиях короткого дня, но температуру повышают до 18-20°С.
Преимущество этого способа состоит в том, что клубни можно длительно хранить без каких-либо дополнительных затрат труда, удобно при необходимости пересылать на большие расстояния.
Однако поскольку на каждом растении образуется всего лишь 1-2 микроклубня, а для клубнеобразования пригодны только нижние черенки, то коэффициент размножения при этом способе оказался не очень высоким. Поэтому он представляет практический интерес только для отдельных частных случаев, а в массовом безвирусном семеноводстве картофеля в основном используется метод черенкования.
Сейчас технологии клонального размножения ин внтро на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений, однако потребности мирового рынка удовлетворяются не более чем на 20%. Основные недостатки клонального микроразмножения и оздоровления растений- большая трудоемкость и высокие затраты. Необходима автоматизация всех процессов, для чего нужна разработка принципиально новых приемов, среди которых можно назвать отказ от укоренения растений, привлечение для этого техники гидро- и аэропоники, регуляцию и стимуляцию процессов морфогенеза короткими световыми импульсами разного спектрального состава; применение полимеров, регулирующих водоснабжение растения согласно потребности.