Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель И. В. Тимофеева Кафедра «Прикладная биотехнология» методические указания

Вид материала

Методические указания

Содержание Практическая работа №5Получение моноклональных антител Практическая работа № 6Выделение чистых культур. Получение накопительной культуры Выделение чистой культуры Выделение чистой культуры из отдельной колонии А — шпатель Дригальского; Б Выделение чистой культуры из одной клетки Капельный метод Линднера Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора Определение чистоты выделенной культуры

Подобный материал:

• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 952.2kb.
• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: ст преподаватель, 451.34kb.
• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 200 г. Автор: канд техн, 983.06kb.
• Директор Инженерной Академии д вет н., профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 433.94kb.
• Директор Инженерной Академии Докт вет наук, профессор Е. Б. Никитин " " 2009г. Автор:, 1007.64kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преподаватель Чернетченко, 370.81kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: д т. н.,профессор Никифоров, 453.83kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп., магистр Плевако, 410.07kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: ст преп. Харченко, 566.59kb.
• Директор Инженерной Академии Никитин Е. Б. " " 2009 г. Автор: преп. Жумагулов, 428.14kb.

Практическая работа №5
Получение моноклональных антител

Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.

Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.
В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:



Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.
Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта:
А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:




Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:



В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.
Применение антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже - меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение про¬водят очень мутной среде.
Кроме красителя в качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.
Радиоактивные метки.
Выбор маркера и способа его «привязки» к антигену является одним из важных этапов в проведении анализа. Первоначально широко применялись радиоизо тонные метки (радиоиммунный анализ - РИА), предложенные амери¬канскими исследователями (С. А. Берсон, Р. С. Ялоу, 1959). Однако в последние годы все более широкое использование в Качестве маркеров находят ферменты. Это обусловлено рядом принципиальных трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп ¹²⁵I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования. Изотоп ³Н имеет длительное время жизни (12.5 лет), однако под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых ³Н-соединений тоже ограничено. Кроме того, эффективность счета трития существенно ниже, чем ¹²⁵I. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высо¬кая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования ра¬диоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.
При иммуноферментном анализе антиген связывается с поверхностью лунки полистирольного планшета. В лунку добавляют антитела, несущие фермент в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10-12 г/литр.
В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный ре¬зультат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.
Для введения ферментативной метки разработано много разных химических, биохимических и иммунологических способов.
Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.
Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако к некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.
Один из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент (рис. 19, а). Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколе¬ния, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.
Другой путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого антигена и фермента, которые соединяют между собой через антитела другого вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.
Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.
Кроме ферментов в качестве маркеров могут быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе применяются в качестве меток АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой.


Контрольные вопросы:

1. Что такое моноклональные антитела?
   
2. Что представляет собой иммунофлюоресцентный метод получения моноклональных антител.?
   
3. Каким образом можно вызвать усиление сигнала?
   
4. Как действует система «биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин»?
   
5. Какие вещества используют в качестве маркеров при получении моноклональных антител?
   

Задание для СРСП:

1. Система «антиген-антитело»

2. Получение моноклональных антител.


Задание для СРС:

Оформить результаты практической работы № 5. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП. Составить 20 тестовых заданий по темам лекции и практической работы № 5.


Практическая работа № 6
Выделение чистых культур.



Физиологию, биохимические свойства, циклы развития микро­организмов исследуют, как правило, при работе с чистыми куль­турами. Чистой, или аксенической, культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Уме­ние выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популя­ции, существующей в природе, и поддерживать чистоту культу­ры — необходимое условие работы с микроорганизмами. Выделе­ние чистой культуры обычно включает три этапа: получение на­копительной культуры; выделение чистой культуры; определение чистоты выделенной культуры.

ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Накопительной называют такую культуру, в которой преобла­дают представители одной физиологической группы или даже од­ного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С. Н. Вино-градским и М. Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных, т. е. избирательных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или груп­пы микроорганизмов из смешанной популяции.

При создании элективных условий необходимо знать физиоло­гию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать выделяемые микроорганизмы. Элективные условия соз­дают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку различные микроорганизмы для своего развития предъявляют не­одинаковые требования к источникам питания. Например, микро­организмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного раз­нообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры ав-тотрофных микроорганизмов получают на средах, где единствен­ным источником углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соединений углерода задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфические питательные среды, удовлетворяющие пот­ребности преимущественно одной группы микроорганизмов, носят название элективных. В зарубежной литературе большее распро­странение получили термины «накопительные» или «селективные» среды.

Накопительные культуры микроорганизмов, обладающих высо­кой требовательностью к составу питательных сред, получают иначе. При их выделении используется неодинаковая чувстви­тельность клеток смешанной популяции к продуктам обмена ве­ществ, накапливающимся в среде. Примером могут служить мо­лочнокислые бактерии, для накопления которых используют соло­довое сусло без мела, т. е. среду, первоначально не обладающую элективностью. После внесения природного материала, содержа­щего молочнокислые бактерии, в среде вначале наряду с молоч­нокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов Enterobacter и Escherichia. Однако по мере накопления в среде молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетерофер-ментативными видами, условия для развития энтеробактерий и эшерихий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бак­терии, которым свойственна высокая кислото- и спиртоустойчи-вость, продолжают расти. Таким образом, в результате развития молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень элективности, что и обеспечивает получение накопительной куль­туры этих бактерий. Другим примером могут служить уксусно­кислые бактерии, которые характеризуются высокой устойчиво­стью к этиловому спирту. Накопление этих бактерий осуществля­ют на сусле, к которому добавляют 4—5% этанола.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных попу­ляций в среду включают антибиотики, которые отличаются спе­цифичностью действия и позволяют избирательно подавить рост определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия для развития грамотрицательных бактерий можно создавать вне­сением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 да 100 мг/л, поскольку многие виды грамположительных бактерий при этом или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы создать благоприятные условия для развития бактерий и, напро­тив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризео-фульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.

При создании элективных условий следует учитывать неодина­ковое отношение различных микроорганизмов к аэрации, темпе­ратуре, кислотности среды и т. д. Поэтому при получении накопи­тельной культуры аэробных микроорганизмов обеспечивают боль­шую поверхность контакта среды с воздухом, а для обогащения среды анаэробными микроорганизмами тем или иным способом создают анаэробные условия. Культивирование при высокой тем­пературе (50° и выше) исключает развитие мезофильных микро­организмов и обеспечивает рост термофилов. Селективным факто­ром может служить также неодинаковая скорость роста различ­ных микроорганизмов при данной температуре. Например, на ми­неральной среде при освещении и температуре 35° удается почги полностью подавить рост зеленых водорослей и получить культу­ру, обогащенную цианобактериями.

При получении накопительных культур следует учитывать и та­кие особенности микроорганизмов, как способность к образованию эндоспор. Для накопления спорообразующих бактерий среды ино-кулируют, как правило, субстратом, который предварительно пас­теризуют, т. е. кратковременно прогревают при высокой темпера­туре (10 мин при 75° или 2—5 мин при 80°). Таким образом можно полностью или почти полностью исключить развитие бак­терий, не образующих опоры.

Следует иметь в виду, что элективные условия далеко не всег­да оптимальны для роста выделяемых микроорганизмов, однако они лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами.

О получении накопительной культуры судят по появлению ха­рактерных признаков развития выделяемых микроорганизмов — помутнение среды, иногда сопровождаемое пигментацией, появле­ние пленки, осадка, выделение газов. Помимо визуального наблю­дения накопительную культуру микроскодируют и выявляют при­сутствие желаемых форм. Иногда необходимо определить продук­ты метаболизма, образование которых свойственно выделяемым микроорганизмам. Например, о развитии нитрифицирующих бак­терий свидетельствует появление в среде нитрит- и нитрат-ионов и уменьшение или даже полное исчезновение иона аммония.

Основные условия элективности, позволяющие получить нако­пительные культуры микроорганизмов с разным типом обмена ве­ществ, суммированы в табл. 9.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

После того как получена накопительная, приступают к выделе­нию чистой культуры. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или одной клетки.

Выделение чистой культуры из отдельной колонии

Основным методом выделения чистых культур микроорганиз­мов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его за­ключается в получении чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения микроорганизмов, которые не растут или плохо растут на плотных средах. К числу таких микроорганизмов относятся некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие.

При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или жела­тину, разливают в стерильные чашки Петри. После того как сре­да застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю нако­пительной культуры или ее разведения в стерильной воде и сте­рильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют кап­лю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,



Рис 1. Рассев культуры микроорганизмов на поверхность плот­ной среды шпателем:

А — шпатель Дригальского; Б — рассев; В — рост микроор­ганизмов после рассева

затем по второй половине, после чего этим же шпателем протира­ют поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюда­ют сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих — изолированные колонии (рис. 1). Рассевать накопительную куль­туру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности .плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рис. 2. Перед каждым новым штрихом петлю стери­лизуют в пламени горелки.

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз» чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки-Петри при застывании агара, не помешала получить изолирован­ные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1—7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность ско­шенной плотной среды в пробирки или в жидкую среду.



Рис. 2. Схема рассева культуры микроорганизмов на поверхность-плотной ореды петлей




Изолированные колонии аэротолерантных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного досева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15—20 мл и стерилизуют. Непосредст­венно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную ба­ню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений на­копительной культуры в стерильной водопроводной воде. Разведе­ния готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5—1,0 мл раз­ведения получить изолированные колонии. Степень разведения оп­ределяется плотностью накопительной культуры. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48—50°агаризованной средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки выни­мают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени го­релки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри по­мещают в термостат. Колонии, выросшие в /толще среды, выреза­ют стерильным скальпелем или извлекают стерильными капил­лярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую сре­ду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облитатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на по­верхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом раз­ведения. Сущность его заключается в том, что разведения накопи­тельной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45—50° агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последо­вательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаж­дают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (соотношение 3:1), что препятствует про­никновению воздуха в толщу агаризованной среды.

Иногда агаризованную питательную среду после посева и тща­тельного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилля­ра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь образовавши-

еся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стериль­ной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик ага­ризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стериль­ную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислорода, че­рез капилляр, который помещают между стенкой пробирки и ага­ризованной средой. Агаризованную среду из трубки Буррл выду­вают, пропуская газ через ватную пробку.

Иногда плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробир­ку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика лег­ко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара раз­резают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и уча­стки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Для получения изолированных колоний ме­тодом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные пита­тельные среды.

Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характери­зующихся особенно высокой чувствительностью к кислороду (экстремальные анаэробы)-, исполь­зуют метод вращающихся пробирок Хангейта. Сущность этого метода заключается в следую­щем. Расплавленную агаризованную среду за­севают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволя­ет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом (рис. 42).

В некоторых случаях бывает достаточно од­ного посева в плотную среду, чтобы получить чистую культуру. Однако чаще посев в плотную питательную среду повторяют 2—3 раза. В качестве посевного материала при этом используют культуру, получен­ную из отдельной колонии.

Выделение чистой культуры из одной клетки

Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным методом, с помощью микроманипулятора или микроселектора.

Капельный метод Линднера используют при работе с крупны­ми микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, во­дорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в неболь­шой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на по­верхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат «висячая капля». Нанесенные на покровное стекло кап­ли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых об­наружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через. 12—24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в. которых наблюдается образование микроколоний, осторожно сни­мают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора-Микроманипулятор — прибор, позволяющий с помощью специ­альной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку и» суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микро­манипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микро­скопа установлена влажная камера, в которую помещают препа­рат «висячая капля». В держателях операционных штативов за­креплены микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во-влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в ви­сячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает от­дельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со» стерильной жидкой средой.

Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Пер­фильева. Наиболее существенной частью микроселектора Пер­фильева является стеклянный микрокапилляр, имеющий строга прямоугольное сечение. Благодаря этому канал капилляра хоро­шо просматривается даже с иммерсионным объективом. Стериль­ный капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток в агари-зованной питательной среде и при большом увеличении микроско­па находят участок с одной клеткой. Специальным приспособле­нием этот участок капилляра стерильно выбивают в приемник, и* которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких микроорганизмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ

Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами: визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматри­вается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошен­ной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, куль­тура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред.

Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контро­лировать под микроскопом. Для этого следует приготовить препа­рат фиксированных окрашенных клеток и просмотреть его с им­мерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однород­на; допустимо лишь незначительное варьирование размеров кле­ток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий, например, микобактерий, нокардий и др., очень полиморфны, поэ­тому определение чистоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения. Чистоту культур микроорганиз­мов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Пре­жде всего выделенную культуру высевают на питательную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний — свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на мясо-пеп-тонный агар — среду, которая обеспечивает рост многих хемоге-теротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или отсутствие роста, если данные микроорга­низмы на мясо-пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганиз­мов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Осо­бенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также пред­ставителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганиз­мов проверяют высевом еще на ряд сред — сусло, мясо-пептон-ный бульон, картофельный агар и др. Набор сред и их состав оп­ределяются особенностями метаболизма выделенных микроорга­низмов, а также их возможных спутников.


Контрольные вопросы:

1. Какую культуру можно считать чистой?
   
2. Что такое накопительная культура?
   
3. Каковы условия получения накопительной культуры?
   
4. Каковы особенности выделения чистой культуры из отдельной колонии?
   
5. Каковы особенности выделения чистой культуры из отдельной клетки?
   

Задания для СРСП:

1. Выделение чистой культуры.
   
2. Определение чистоты культуры.
   

Задание для СРС:

Оформить результаты практической работы № 6. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП. Составить 30 тестовых заданий по темам лекции и практической работы № 6.