Тезисы докладов

Вид материала

Тезисы

Содержание Выяснение роли нового амилоидного белка гладких мышц смитина в патогенезе амилоидозов с целью разработки методов их ранней диагн Структурное исследование церулоплазмина крысы

Подобный материал:

• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Тезисы докладов, 1225.64kb.
• Правила оформления тезисов докладов Тезисы докладов предоставляются в электронном виде, 22.59kb.
• «Симпозиум по ядерной химии высоких энергий», 1692.86kb.
• Требования к тезисам докладов, 16.83kb.
• Тезисы докладов научно-практической, 6653.64kb.
• Тезисы докладов 1 Межвузовская научно -практическая конференция студентов и молодых, 100.64kb.
• Тезисы докладов и заявки на участие, 104.97kb.
• Тезисы докладов, принятые Оргкомитетом для опубликования в Материалах форума, 788.61kb.
• Тезисы докладов, принятые Оргкомитетом для опубликования в Материалах форума, 1066kb.

ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ НОВОГО АМИЛОИДНОГО БЕЛКА ГЛАДКИХ МЫШЦ СМИТИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ АМИЛОИДОЗОВ С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ

ИХ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И КОРРЕКЦИИ.

З.А.Подлубная¹⁾, Л.Г.Бобылёва¹⁾, А.Г.Бобылёв¹⁾, А.Б.Гехт²⁾, Т.В.Гордиенко³⁾, А.А.Федюшин³⁾

¹⁾Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. области; ²⁾Российский Государственный медицинский университет, Москва; ³⁾Больница Пущинского научного центра РАН, Пущино, Моск. области.


Амилоидные отложения, неограниченно растущие в разных органах и тканях, – основной признак амилоидозов, от которых страдают миллионы пациентов. Доклиническая диагностика амилоидозов, их предупреждение или своевременное эффективное лечение являются главными задачами. Один из подходов к решению этих задач – изучение амилоидогенеза in vitro. В рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» при изучении амилоидогенеза in vitro нами были открыты 4 новых амилоидных белка семейства тайтина скелетных и сердечной мышц (тайтин, С-, Х- и Н-белки), возможных участников амилоидозов in vivo. Обнаружено сходство свойств их амилоидных фибрилл с таковыми Аβ-пептидов мозга, наблюдаемых при болезни Альцгеймера. Определена динамика формирования амилоидных агрегатов белками семейства тайтина и Аβ-пептидами 25-35 и 1-42 мозга. Установлено разрушающее действие тетрациклина на эти амилоиды и предотвращающее их образование. Антиамилоидное действие препаратов было подтверждено на клеточных культурах ПМЯЛ и нервных клеток по увеличению в их присутствии выжи-ваемости клеток. При дальнейшем изучении амилоидоза in vitro мы открыли новый амилоидный белок смитин в гладких мышцах. Были найдены условия, в которых смитин формировал аморфные агре-гаты, подобные амилоидным агрегатам белков семейства тайтина и Аβ-пептидов мозга. Их амилоидная природа была подтверждена специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) было показано антиамилоидное действие на амилоиды смитина, Х-белка и Аβ-пептидов мозга гидратированного фуллерена С₆₀ и его раст-воримых производных: натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С₆₀, фуллеренола, комплексов фуллерена С₆₀ с поливинилпирролидоном (ПВП), а также нитропроизводных фуллерена С₆₀. По данным ЭМ эти вещества разрушали амилоиды смитина, Х-белка и пептидов мозга и предотвращали образование новых агрегатов. Их антиамилоидный эффект был подтвержден флуоресцентным методом. На культуре клеток карциномы гортани человека HEp-2 была проверена токсичность антиамилоидных пре-паратов. Натриевая соль поликарбоксильного производного фуле-рена С₆₀ оказалась токсичной. Среди исследованных производных фуллерена C₆₀ были отобраны фуллеренол и комплексы фуллерена С₆₀ с ПВП как наиболее эффективные и нетоксичные антиамило-идные вещества, на основе которых могут быть созданы антиамило-идные препараты. Метод определения токсичности позволяет проверить на токсичность не только амилоиды на разных стадиях их формирования и сами препараты, но и фрагменты распада амилоидов, что также отвечает требованиям практики. Такой подход в комплексе с визуальной оценкой с помощью высокоразрешающей ЭМ позволяет осуществлять подбор наиболее ценных лекарственных средств борьбы с разными амилоидами и амилоидозами, что является задачей дальнейших наших исследований вместе с поисками и изучением амилоидных свойств у других мышечных белков.

СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА КРЫСЫ

В.Р.Самыгина¹⁾, А.В.Соколов²⁾, Т.С.Ситник¹⁾, Е.В.Родина¹⁾, М.О.Пулина²⁾, Е.Т.Захарова²⁾, В.Б.Васильев²⁾

¹⁾ Институт кристаллографии РАН, Москва

²⁾ ГУ НИИ экспериментальной медицины, Санкт-Петербург


Церулоплазмин (ЦП, ферро-О2-оксидоредуктаза) – медь-содержащая оксидаза плазмы крови, белок острой фазы воспаления. Церулоплазмин является мультифункцинальным белком и обладает несколькими ферментативными активностями: ферроксидазной, купроксидазной, супероксиддисмутазной и пероксидазной. ЦП препятствует образованию активных форм кислорода. ЦП используется в терапии как антиоксидант, стимулятор гемопоэза при иммунодепрессии и интоксикации.

ЦП млекопитающих обладает высокой гомологией, однако этот белок из различных источников имеет ряд особенностей. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии, фармакологии, трансплантологии, иммунологии, онкологии и изучении старения и сердечно-сосудистой системы. В последние годы появился интерес к изучению церулоплазмина крыс [1]. В связи с этим представляется актуальным сравнение церулоплазмина крысы и человека, поскольку важны не только результаты исследования патологий, проводимых на данной модели, но и правильная экстраполяция результатов.

С целью проведения рентгеноструктурного анализа нами были проведены работы по кристаллизации церулоплазмина крыс. Кристаллизация ЦП крысы проводилась методом диффузии в парах. Для широкого скрининга начальных условий использовались коммерческие скриниги фирмы Hampton Research. Для проведения эксперимента использовались роботы Москито и Текан. Кристаллизация проводилась при температуре 4 градуса. В результате были получены голубые гексагональные кристаллы размером 0.02 мм. Кристаллы были протестированы при 100К на станции синхротронного излучения ID 14-1, ESRF, Гренобль, Франция. Пространственное разрешение, до которого рассеивали кристаллы, составляло 20 Å. Поскольку дифракционное качество кристаллов не позволяло произвести рентгеноструктурный анализ, была изменена методика выделения и очистки церулоплазмина. Был разработан новый, двухэтапный метод очитки ЦП на основе его взаимодействия с неомецином. На первом этапе плазма крови с добавлением к ней ЭДТА и 6-аминокапроновой кислоты очищалась на колонке UNOQ-Sphere, на второй стадии использовали колонку с неомицин-агарозой. Продолжены работы по оптимизации условий кристаллизации ЦП, полученного по новой методике.

Для предварительного анализа структуры ЦП крысы было проведено математическое моделирование белка с использованием программы Розетта. Было проведено сравнение полученной модели со структурой ЦП человека. Выявлено, что в целом структура ЦП крыс очень близка к структуре ЦП человечека, однако биоинформационный анализ позволил выявить различия в сайте связывания фенилдиамина и азида. ЦП крысы содержит в данном сайте треонин вместо важного для связывания Trp669 у ЦП человека. Также Нis667, вероятно образующий стекинг с Trp669 в этом центре связывания у ЦП человека, в ЦП крысы заменен на лейцин. Ser622 церулоплазмина консервативен, но у ЦП крысы, видимо, уже не играет стабилизирующей роли при связывании субстратов. Из полученных данных можно сделать вывод о более слабом связывании фенилдиамина и азида с ЦП крысы и соответственно более низкой оксидазной активности фермента по отношению к субстратам в данном сайте, что подтверждает биохимические данные.


[1] Lane DJ, Robinson SR, Czerwinska H, Bishop GM, Lawen A. Biochem. J. (2010) 432 pp.123–132.