Ключарева Светлана Викторовна доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович Ведущая организация: гоу дпо санкт-Петербургская медицинская академия последиплом

Вид материала

Диплом

Содержание Научные консультанты Горланов Игорь Александрович Ведущая организация Ученый секретарь совета Актуальность исследования Цель исследования Задачи исследования. Научная новизна. Практическая значимость. Личное участие автора в получении результатов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Реализация и внедрение полученных результатов работы Апробация и публикация материалов исследования. Структура и объем диссертации. Материалы и методы исследования Методы приготовления липосом и лекарственных липосомальных комбинаций. 2. Культуральные методы исследования. Метод радиометрической оценки пролиферативной активности клеток. Определение концентрации восстановленного глутатиона Определение концентрации сульфгидрильных групп белков ... Полное содержание

Подобный материал:

• Кувакин Владимир Иванович Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор, 361.78kb.
• Лучкевич Владимир Станиславович Доктор медицинских наук, профессор Кочорова Лариса, 358.38kb.
• Симерзин Василий Васильевич доктор медицинских наук, профессор Никитин Олег Львович, 452.7kb.
• Жирков Анатолий Михайлович доктор медицинских наук профессор Симбирцев Андрей Семенович, 418.79kb.
• Рохлина Майя Леоновна доктор медицинских наук, профессор Игонин Андрей Леонидович доктор, 564.38kb.
• Алексеев Владимир Николаевич доктор медицинских наук, профессор Николаенко Вадим Петрович, 172.08kb.
• Гаврилин Сергей Викторович доктор медицинских наук профессор Волчков Владимир Анатольевич, 770.14kb.
• Халиф Игорь Львович Доктор медицинских наук, профессор Бредихина Наталия Андреевна, 579.47kb.
• Хирманов Владимир Николаевич доктор медицинских наук профессор Карпищенко Анатолий, 277.9kb.
• Котов Сергей Викторович доктор медицинских наук, профессор Савин Алексей Алексеевич, 547.92kb.

На правах рукописи

ГРАШИН

Роман Арикович


КОРРЕКЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЕРАТИНОЦИТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОСОМ И ЕЁ КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА КАК НАПРАВЛЕНИЕ В НАРУЖНОЙ ТЕРАПИИ ПСОРИАЗА


14.01.10 - кожные и венерические болезни

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия

имени С.М. Кирова» МО РФ

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор Барбинов Вячеслав Витальевич

доктор медицинских наук профессор Карпищенко Анатолий Иванович


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Горланов Игорь Александрович

доктор медицинских наук профессор Ключарева Светлана Викторовна

доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович


Ведущая организация:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится “___” декабря 2009 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.01 в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6).


С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан “____” 2009 года

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Пономаренко Геннадий Николаевич


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность исследования. Согласно современным представлениям, псориаз - это хронический воспалительный иммунозависимый генодерматоз, основное патогенетическое звено которого проявляется усилением пролиферативной активности кератиноцитов, приводящей к нарушению процессов кератинизации [Самцов А. В. И соавт., 2002; Барбинов В.В. и соавт.,2008]. При этом в очагах поражения кожи митотическая активность эпидермальных клеток возрастает настолько, что время выхода кератиноцитов на поверхность кожи сокращается по сравнению с нормой с 14 до 2 суток, приводя при этом к полному обновлению эпидермиса всего за 5-6 дней вместо 28 [Шарапова Г.Я. и соавт., 1989]. Подобная скорость пролиферации в норме наблюдается лишь в клетках фолликулярного эпителия и клетках слизистых оболочек. Тем не менее, многочисленные исследования клеточного метаболизма не выявили нарушений, соответствующих изменениям, наблюдаемым при опухолевой прогрессии [Мошкалов А.В.,1995; Шилов В.Н., 2001]. В связи с этим большинство исследователей относит псориаз к сугубо воспалительным дерматозам, а ускоренную клеточную пролиферацию трактуют как результат дисбаланса в системе клеточных регуляторных механизмов.

К таким механизмам, относятся, в том числе, процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты по изучению которых накоплен достаточный опыт. Однако, имеется ряд сообщений в которых указано, что характер процессов свободнорадикального окисления (СРО) при псориазе отличен от общепринятого и непосредственно в клетках кожи имеет инвертный характер [Шилов В.Н. и соавт., 1997, 2001; Хышиктуев Б.С. и соавт., 2000; Тарасенко Г.Н. и соавт., 2002]. Участие этих процессов в пролиферации и дифференцировке кератиноцитов, несомненно, представляет немалый интерес, а их регуляция – новые возможности в наружной терапии.

На сегодняшний день предложено несколько теорий возникновения и развития псориаза, которые в целом не противоречат, а скорее дополняют друг друга. Доминирующей является теория Т-клеточно-опосредованного воспаления в коже, которая объясняет патогенез данного заболевания активацией нескольких субпопуляций лимфоцитов, которые управляют клеточным иммунитетом и контролируют его [Шегай М.М. и соавт., 1998; Шилов В.Н., 2000, 2001; Кrueger J.G., 2002]. Существует также и теория «псориатина» – неопознанного цитокина псориаза, вероятно, продуцируемого самими кератиноцитами и таким образом поддерживающими сам воспалительный и пролиферативный процессы, а также есть ещё ряд других теорий [Скрипкин Ю.К., 1995; Мяделец О.Д. и соавт., 1997].

Оптимальный объём знаний об этиопатогенезе заболевания позволяет разрабатывать адекватную программу терапии. Хотя многие из применяемых сегодня методов лечения принято считать патогенетическими, следует признать, что некоторые их них являются эмпирическими, в лучшем случае симптоматическими и, более того, применение почти всех методов (исключая цитостатические и кортикостероидные препараты, ультрафиолетовое облучение) даёт положительный результат примерно в одни и те же сроки [Шилов В.Н. и соавт., 1995].

Для наружной терапии псориаза традиционно используют препараты следующих групп: разрешающие средства, включая гидроксиантроны (Дёготь, Антралин, Дитранон, Цигнолин); глюкокортикоидные препараты различной силы, как отдельные стероиды, так и в комбинации с кератопластическими препаратами, антибиотиками, анестетиками и другими средствами (Элоком С, Дипросалик, Полькортолон и пр.); синтетические ретиноиды (Тезаротен); синтетические аналоги витамина D₃ (Дайвонекс, Дайвобет) [Соколовский Е.В., ред., 1999; Иванов О.Л. и соавт., 2005; Терлецкий О.В., 2006]. Применение средств для наружной терапии входит в комплекс лечебных мероприятий, направленных в конечном итоге на нормализацию пролиферации клеток кожи. Наружная терапия при этом нередко является ведущей, особенно в стационарном периоде псориаза. Необходимо отметить, что далеко не все препараты являются высокоэффективными и нередко требуют длительного подбора и ещё более длительного применения. Кроме того, препараты всех групп имеют свои недостатки. Так, разрешающие средства обладают выраженным раздражающим действием и не могут быть использованы в остром периоде псориаза [Соколовский Е.В., ред., 1999; Самцов А. В. И соавт., 2002]. Топические кортикостероиды являются гормонами, применение которых вызывает ухудшение регенерации эпидермиса, а при длительном применении - подавление иммунологической функции и атрофию кожи, ослабление лечебного эффекта. Такими же недостатками обладают и производные витамина D₃. Ретиноиды, несмотря на их высокую эффективность, достаточно токсичны [Иванов О.Л. и соавт., 1998; Хойбеш М. и соавт., 1998; Жилова М. Б., 2000].

Препараты для наружной терапии значительно отличаются по механизму своего действия, но ни один из них не обладает комплексным влиянием на клетку с учётом тех звеньев патогенеза, которые приводят к снижению пролиферации и усилению дифференцировки кератиноцитов, устранению иммунологических сдвигов и воспалительного процесса. Отдельные их них, например, созданный на основе витамина D₃, избирательно действует на ядерные рецепторы гистон-нуклеинового комплекса и таким образом подавляет продукцию интерлейкина–1 [Кубанова А.А., 1993; Никулин Н. К. и соавт., 2000]. Цинка пиритионат (Скин-кап) обладает выраженным цитостатическим эффектом, блокируя механизмы репликации нуклеиновых кислот [Соколовский Е.В., ред., 1999]. Кортикостероиды угнетают синтез лейкотриенов, также воздействуя на ядерный аппарат клетки [Суворов А.П., 1988; Шарапова Г.Я. и соавт., 1989; Суворова К.Н., 1996].

Одним из направлений работы явилась необходимость обеспечения эффективной доставки и проникновения лекарственных соединений ко всем клеточным слоям эпидермиса независимо от его толщины на различных участках тела. Доказано, что мембранные структуры клетки практически не воспринимают водорастворимые соединения, наносимые на поверхность рогового слоя, даже если они входят в состав мазей и кремов [Марголис Л.Б. и соавт., 1986; Каплун А. П. и соавт., 1998]. Иными словами, для решения задачи о доставке лекарственных веществ ко всем слоям кожи необходим проводник, способный проникать как внутрь клетки, так и проводить водорастворимые соединения в глубокие участки межклеточного пространства. Есть мнение, что наиболее удобным и вместе с тем физиологичным энхансером являются липосомы, по созданию которых в мире накоплен достаточный опыт, к сожалению, пока, в основном, только лабораторный и косметологический [Бердичевский В.П. и соавт., 1979; Грегориадис Г., 1983; Чубатова С.А. и соавт., 1999; Lasic D., 1993] без широкого практического применения в дерматологии.

Таким образом, слабо изученные механизмы патогенеза болезни, недостатки наружной терапии показали необходимость исследования молекулярных механизмов пролиферации кератиноцитов при псориазе, разработки лекарственных препаратов, способных комплексно и при этом мягко воздействовать на рецепторный аппарат клеток кожи, стабилизировать метаболические процессы, создавая условия для их окончательной дифференцировки и полноценного кератинообразования.


Цель исследования: разработать новое направление наружной терапии псориаза, основанное на комплексной регуляции процессов пролиферации, для чего создать комбинированное лекарственное средство в липосомальной форме, разработать лабораторные показатели его биологической активности и изучить его клиническую эффективность.

Задачи исследования.

1. Исследовать биорегулирующее действие отдельных лекарственных препаратов, включённых в липосомы, на культуры кератиноцитов больных псориазом для выбора наиболее эффективных из них.
   
2. Изучить биорегулирующее действие комбинаций лекарственных препаратов, включённых в липосомы, на культуры кератиноцитов больных псориазом для выбора оптимальной, в наибольшей степени подавляющей их пролиферацию и разработать высокоэффективное комбинированное средство для наружной терапии.
   
3. Изучить клиническую эффективность комбинированного липосомального препарата для наружной терапии псориаза.
   
4. Провести сравнительный анализ динамики разрешения псориатических высыпаний у больных, получавших современные препараты для наружной терапии псориаза с новым антипролиферативным кремом.
   
5. Исследовать молекулярные механизмы регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности кератиноцитов в культуре клеток на основе клинико-лабораторных методов комплексной оценки процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.
   

Научная новизна.

На основе разработанного метода определения чувствительности кератиноцитов подтверждена теория происхождения псориаза как воспалительного дерматоза.

Разработано новое научное направление в наружной терапии дерматозов, основанное на использовании высокоэффективных фармацевтических субстанций, ранее не применявшихся в дерматологии и нанотехнологий (липосом), обеспечивая, таким образом, помимо высокой клинической эффективности, нивелирование побочных эффектов, возникающих при применении современных наружных лекарственных средств.

Установлено, что культуры кератиноцитов больных псориазом выращенные из клеток как поражённых, так и здоровых участков кожи, обладают одинаково высокой пролиферативной активностью и способны длительное время самоподдерживаться без добавления специальных ростовых факторов.

На изолированных культурах псориатических кератиноцитов, с использованием специально разработанного метода оценки чувствительности клеток, установлен антипролиферативный эффект лекарственных препаратов включённых в липосомы и их комбинаций.

На изолированных культурах кератиноцитов больных псориазом с использованием лабораторно-диагностических методов показано поведение систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты и установлена их роль в регуляции клеточной пролиферации, что дополняет и расширяет представления о патогенезе псориаза и способах его лечения.


Практическая значимость.

Разработанное направление наружной терапии псориаза и созданный на этой основе комбинированный лекарственный препарат в форме крема позволяют проводить и в дальнейшем совершенствовать эффективную наружную терапию больных псориазом как в остром (с использованием общей терапии), так и в стационарном (в качестве монотерапии) периодах.

Разработан и апробирован принципиально новый негормональный липосомальный комбинированный лекарственный препарат для наружной терапии псориаза.

Разработанный лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов с использованием клеточных культур позволяет тестировать клетки кожи к известным препаратам для выбора оптимальной терапии ещё до начала лечения и таким образом максимально индивидуализировать проведение наружной терапии, а также создавать новые эффективные препараты комбинированного действия.

Результаты, полученные при изучении систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты свидетельствуют о необходимости включения в состав рецептур для наружной терапии псориаза препаратов прооксидантного действия.


Личное участие автора в получении результатов.

Автор принимал непосредственное участие в получении липосомальных препаратов и их комбинаций, в разработке и внедрении метода тестирования липосомальных препаратов и их влияния на активность пролиферации в культурах клеток, в разработке и создании липосомального комбинированного препарата, а также непосредственно проводил сбор и обработку материала в ходе клинической части исследования. Автор лично выпол­нил все методики по исследованию систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.

Автор составил план настоящего исследования, сформировал базу данных, провёл аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы, статистическую обработку и обобщение полученных ре­зультатов, сформулировал выводы и практические рекомендации.


Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Культуры кератиноцитов кожи больных псориазом как с поражённых, так и с непоражённых участков обладают высокой пролиферативной активностью и способны длительное время самоподдерживаться без добавления специальных ростовых факторов, что свидетельствует о том, что кератиноциты больного псориазом способны секретировать собственные факторы роста.

2. Лекарственные препараты механизм действия, которых, связан с подавлением клеточной пролиферации: пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол, переведённые в липосомальную форму, обладают антипролиферативным действием на кератиноциты больных псориазом (подавление включения ³Н-тимидина в 4,2; 4,2; 3,2; 2,5 и 2.2 раза соответственно).

3. Комбинации из наиболее эффективных липосомальных лекарственных препаратов (пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина) целесообразно использовать в качестве лекарственных средств для наружной терапии псориаза, так как они обладают синергидным действием (подавление включения ³Н-тимидина в 36,2 и в 23 раза соответственно).

4. Комбинированный препарат, в состав которого входят липосомальные: пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания, так как не обладает раздражающим эффектом и по клинической эффективности не уступает современным наружным средствам (чувствительность 93,9% стационарных и 90% амбулаторных больных; скорость разрешения псориатических элементов кожной сыпи: 4-5 нед у больных с ограниченной и 7-8 нед при распространённой формах болезни).

5. При псориазе увеличение интенсивности свободнорадикального окисления ведёт к остановке клеточной пролиферации, а высокий уровень антиокислительной защиты её поддерживает.


Реализация и внедрение полученных результатов работы

На основе полученных в ходе исследования результатов разработан и внедрён в практику липосомальный биорегулирующий препарат для наружной терапии псориаза. Патент на изобретение №2196583 «Средство для наружной терапии псориаза и способ его изготовления» от 20.01.2003 г.

Разработан лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов больных псориазом к лекарственным липосомальными препаратам, в том числе и к ранее не применявшимся в дерматологии в качестве наружных средств. Патент на изобретение № 2361219: «Способ определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к лекарственным препаратам» от 16.04.2008 г.

Результаты, полученные в ходе исследования, были использованы при разработке и внедрении в клиническую практику дерматологических учреждений Санкт-Петербурга препаратов для наружной терапии и профилактики различных дерматозов, а также серии липосомальной косметической продукции.

Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней и кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии, на кафедрах и клиниках дерматовенерологии СПбГМУ им И.П. Павлова, СПбГМА им. И.И. Мечникова, в лечебно-диагностическом процессе в кожно-венерологических диспансерах Санкт-Петербурга и медицинском центре «Альтермед».


Апробация и публикация материалов исследования.

Основные положения диссертационного исследования были доложены и обсуждены на: 1-ом Европейском конгрессе по псориазу (Париж, 2004); I Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2005); II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики" (Санкт-Петербург, 2008); VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях" (Санкт-Петербург, 2003); Юбилейной научной конференции посвящённой 80-летию кафедры микробиологии ВМедА и 300-летию основания Санкт-Петербурга «Современная микробиология клинической медицине» (Санкт-Петербург, 2003); Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии, косметологии и ИППП»: посвящённой 10-ти летию кафедры кожных и венерических болезней с курсом дерматокосметологии ФУВ (Москва, 2003); второй научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008).

По теме диссертационного исследования опубликовано 30 научных работ, из них 10 в рецензируемых журналах, получены патенты на 2 изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, 3 главы полученных результатов с их обсуждением, заключения и выводов. Работа изложена на 231 странице машинописного текста, содержит 12 рисунков, 9 таблиц. Список литературы состоит из 368 источников, из них 252 отечественных и 114 иностранных авторов.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работа проводилась по двум основным направлениям – экспериментальному и клиническому.

Экспериментальная (клинико-лабораторная) часть исследования заключалась в последовательном проведении следующих этапов работы:

- приготовления липосом и лекарственных липосомальных комбинаций;

- культивирования кератиноцитов, полученных от больных псориазом;

- изучения антипролиферативной активности отдельных липосомальных фармацевтических препаратов и их комбинаций на полученных культурах кератиноцитов;

- изучения состояния систем СРО и АОЗ на полученных культурах кератиноцитов.

Клиническая часть исследования предусматривала:

-изучение клинической эффективности созданного препарата для наружной терапии - крема Липсор в амбулаторных и стационарных условиях;

-сравнение крема Липсор с наиболее эффективными современными препаратами для наружной терапии псориаза.

1. Методы приготовления липосом и лекарственных липосомальных комбинаций. Изготовление липосом и включение в них лекарственных субстанций производилось по методу Г. Грегориадиса, А. Аллисона (1983), в нашей модификации [Грегориадис Г. и соавт., 1983; Грашин Р.А., 2008].

Таким образом, были приготовлены липосомальные эмульсии: пентоксифиллина, этмозина гидрохлорида, сальбутамола, натрия селенита, глутатиона окисленного, кальция хлорида и фторурацила, а также различные липосомальные комбинации из данных препаратов. Размер частиц составлял от 50 до 200 нм.

2. Культуральные методы исследования. Выделение первичной культуры кератиноцитов человека осуществлялось по методу Rheinwald J.G., Green H. (1975), в нашей модификации [Грашин Р.А., 2008;]. В этих условиях кератиноциты образовывали колонии, вытесняя фибробласты. Такая система может быть использована для изучения не только дифференцировки клеток кожи и различных ее патологических изменений, но и для тестирования лекарственных препаратов, влияющих на эпидермис.

Метод радиометрической оценки пролиферативной активности клеток. Влияние составных частей антипсориатического крема Липсор оценивали по включению в клетки меченых предшественников синтеза ДНК. Все эксперименты по определению пролиферативной активности кератиноцитов проводили в 4 параллельных пробах. Радиоактивность измеряли на синтиляционном анализаторе «Tracor Analytic Delta 300» (6891 Liquad Scintillation System) (Великобритания). Фотографии изготавливали с помощью компьютерной системы анализа изображения, состоящей из стандартного светового микроскопа, монохромной камеры «Chiper» (США), платы захвата изображения «Utech» (США) и программного морфометрического пакета «Image-Pro-Plus» (США).

3. Методы исследования свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты тканей на модели культур кератиноцитов при использовании отдельных липосомальных препаратов и их комбинаций.

Исследование параметров СРО и антиокислительной защиты (АОЗ) проводилось до и после воздействия препаратов, наиболее сильно подавляющих пролиферативную активность: пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита, сальбутамола, а также смесей препаратов, состоящих из пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита – как наиболее активной и пентоксифиллина и натрия селенита – как наименее активной в отношении антипролиферативной деятельности. Поражённый и непоражённый участки кожи мы в данном исследовании не дифференцировли, т.к. ранее было установлено, что кератиноциты с обоих участков у всех пациентов после добавления ростовых факторов обладали практически одинаковой способностью к росту и размножению.

Для исследования процессов свободнорадикального окисления и антиокидантной защиты клетки культур снимались с лунок 2 раза: после того как активно пролиферировали, т.е. перед воздействием липосомальных смесей и отдельных препаратов, и после воздействия, через 48 часов, т.е. после подавления пролиферации. В качестве контроля использовались культуры кератиноцитов здоровых доноров.

Для определения активности глуатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), супероксиддисмутазы (СОД) каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6ф-ДГ) использовали очищенную цитоплазматическую фракцию, которую получали дифференциальным центрифугированием.

Определение концентрации восстановленного глутатиона производили по методике G.L. Ellman (1959) [Карпищенко А.И., ред., 2002] в нашей модификации. Концентрацию восстановленного глутатиона выражали в мкмоль/г ткани.

Определение концентрации сульфгидрильных групп белков в кератиноцитах производили по методу G.Bellomo (1990). Содержание выражали в мкмоль/г ткани.

Определение концентрации диеновых конъюгатов осуществляли по методике И.Д. Стальной (1977) [Карпищенко А.И., ред., 2002] в нашей модификации. Концентрацию ДК выражали в нмоль/г ткани.

Определение концентрации малонового диальдегида осуществляли по методу M. Uchiyama (1978) в нашей модификации [Карпищенко А.И., ред., 2002]. Концентрацию ТБК-продуктов выражали в нмоль/г ткани.

Определение общей антиокислительной активности производили методом Е.Б. Спектор, А.А. Ананенко и Л.Н. Политовой (1984) в модификации Н.С. Немченко (1989).

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) производили по методу А.Н. Гавриловой (1986). Активность фермента выражали в ммоль/(мин·г белка).

Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) осуществляли методом I. Carlberg и B. Mannervik (1985). Активность выражали в мкмоль/(мин·г белка).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49.) определяли по методу A.Kornberg и соавт. (1955). Результаты выражали в мкмоль/(мин·г белка).

Определение активности супероксиданиондисмутазы (КФ 1.15.1.1.) проводилось по методу Чумакова В.Н. (1977). Результаты выражали в мкмоль/мин ^. г белка.

Для определение активности каталазы (КФ 1.11.1.6.) использовался метод М.А. Королюка и соавт.(1988). Результаты выражали в мкмоль/мин ^. г белка.

Содержание белка в пробах определяли методом Лоури в модификации G.L. Peterson (1977) и выражали в г/л.


4. Методика проведения клинических исследований.

Клиническая характеристика больных.. Под нашим наблюдением находилось 2260 больных. Больные отбирались из числа пациентов клиники кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии, районных кожно-венерологических диспансеров и центра «Альтермед» г. Санкт – Петербурга. Критерием отбора являлось наличие заболевания в течение 12 месяцев и более, подтвержденное медицинской документацией (табл.1)

Тяжесть болезни оценивалась по индексу площади и тяжести псориатических поражений PASI (Psoriasis Area and Severity Index) [Адаскевич В.П., 2004; Carlin C.S. et al., 2004] (легкая степень – < 12 баллов, средняя - ≥ 12 – 20 < баллов, тяжелая - ≥ 20 баллов). (табл. 2).

Сезонность псориаза оценивалась по данным медицинской документации и путем сбора анамнеза (табл.1).

Для оценки эффективности применения крема Липсор в качестве наружного средства для лечения псориаза использовался опросник оценки симптомов псориаза PSA (Psoriasis Symptom Assessment), который заполнялся больными до и после лечения.

Всем больным, находившимся на стационарном лечении, при поступлении и перед выпиской проводилось исследование клинико-биохимического и сокращённого иммунологического статуса.

В качестве контроля использовался индифферентный крем, имевший идентичную с Липсором основу, но без активных ингредиентов, т.н. «плацебо».


Таблица 1

Общая характеристика больных

Категории	Больные
	Количество	%
Пол:
Мужской	1541	68
Женский	719	32
«Семейный» анамнез:
Есть	712	31,5
Нет	1548	68,5
Возраст начала болезни:
< 40 лет (I тип)	1723	76,2
≥ 40 лет (II тип)	537	23,8
Амбулаторное лечение	1680	74
Стационарное лечение	580	26
Всего:	2260	100

Контрольную группу составили 20 стационарных больных, одновременно получавшие крем Липсор и плацебо на различные, как правило, симметричные очаги поражения.

В ходе исследования пациенты были разделены на 3 группы: 2 основных и группу сравнения (табл. 2) В первую группу вошли больные с ограниченными формами псориаза, во вторую – с распространённой и диффузными формами. Группу сравнения составили 260 амбулаторных больных вульгарным псориазом, которым для наружной терапии назначались «Элоком С», «Дайвонекс», «Скин-кап».

Крем наносился на поражённые участки кожи два раза в сутки. Курсовая доза составила от 60 до 300 г препарата в зависимости от характера и распространённости поражения кожи. Больные также получали общую терапию, которая включала в себя фолиевую и аскорбиновую кислоты перорально


Таблица 2

Клиническая характеристика больных

Категории	Больные
	Количество	Проценты
Клиническая форма:
ограниченный псориаз	1239	54,8
ограниченный экссудативный псориаз	82	3,6
распространённый псориаз	838	37
диффузный псориаз	101	4,4
Всего:	2260	100
Тяжесть болезни (по индексу PASI):
Легкой степени (< 12 баллов)	1594	70
Средней степени (≥ 12 - 20 < баллов)	401	17,7
Тяжелой степени (≥ 20 баллов)	265	11,7
Всего:	2260	100
Сезонность:
Летняя форма	331	14,6
Смешанная форма	409	18,1
Зимняя форма	1520	67,2
Всего:	2260	100
Течение:
Интермиттирующее	1542	68,2
Часторецидивирующее	718	31,8
Всего:	2260	100

цианкобламин и глюконат кальция внутримышечно. 40% амбулаторных больных использовали Липсор как монотерапию.

Эффективность лечения оценивалась: - по определению индекса PASI до начала терапии, еженедельно и в конце срока наблюдения (число, размер и распространённость высыпаний, выраженность эритемы, инфильтрации, шелушения); - субъективным ощущениям больного (жжение, зуд, сухость кожи).

Окончательный итог исследования определялся на основании достигнутого результата лечения: клиническая ремиссия, значительное улучшение, незначительное улучшение, без изменений, ухудшение; определения индекса PASI.

Переносимость препарата оценивалась по следующим параметрам: очень хорошая, хорошая, плохая, очень плохая.


5. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по критерию t Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде X_ср  m_x.