Ключарева Светлана Викторовна доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович Ведущая организация: гоу дпо санкт-Петербургская медицинская академия последиплом

Вид материала

Диплом

Содержание Результаты исследований и их обсуждение 2. Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на 3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на Состояние системы свободнорадикального окисления и Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на состояние 3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на про- и Клиническое исследование

Подобный материал:

• Кувакин Владимир Иванович Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор, 361.78kb.
• Лучкевич Владимир Станиславович Доктор медицинских наук, профессор Кочорова Лариса, 358.38kb.
• Симерзин Василий Васильевич доктор медицинских наук, профессор Никитин Олег Львович, 452.7kb.
• Жирков Анатолий Михайлович доктор медицинских наук профессор Симбирцев Андрей Семенович, 418.79kb.
• Рохлина Майя Леоновна доктор медицинских наук, профессор Игонин Андрей Леонидович доктор, 564.38kb.
• Алексеев Владимир Николаевич доктор медицинских наук, профессор Николаенко Вадим Петрович, 172.08kb.
• Гаврилин Сергей Викторович доктор медицинских наук профессор Волчков Владимир Анатольевич, 770.14kb.
• Халиф Игорь Львович Доктор медицинских наук, профессор Бредихина Наталия Андреевна, 579.47kb.
• Хирманов Владимир Николаевич доктор медицинских наук профессор Карпищенко Анатолий, 277.9kb.
• Котов Сергей Викторович доктор медицинских наук, профессор Савин Алексей Алексеевич, 547.92kb.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Исследования в культурах клеток

1. Пролиферативно-дифференцировочная активность культур (контроль) кератиноцитов до воздействия липосомальными препаратами и их комбинациями.

Для выделения первичной культуры кератиноцитов использовались лоскуты кожи, взятые в стерильных условиях у больных псориазом из очага поражения и с неизмененного участка.

Кератиноциты, выделенные из пораженного участка кожи больных псориазом, пролиферировали более интенсивно и на 20-е сутки культивирования образовали 80-90% монослоя (рис.2), в то время как кератиноциты, выделенные с неизмененного участка кожи больных, образовали не более 40% монослоя (рис.3). Примечательно, что клетки, выделенные с непораженного участка кожи, через несколько дней под воздействием фактора роста, содержащегося в питательной среде, резко усиливали активность пролиферации, которую они приблизили к поведению клеток, выделенных из очагов поражения, и в дальнейшем степень их пролиферации не отличалась.

Частота включения ³Н-тимидина в кератиноциты поражённых и непоражённых участков эпидермиса составила 3178±126 и 2750±195 имп./мин (табл. 3), соответственно, и не имела достоверных отличий.

2. Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на

пролиферацию культур кератиноцитов.

С целью последующего выбора оптимальной лекарственной комбинации для создания наружной лекарственной формы нами проведены исследования и дана оценка антипролиферативного действия отдельных лекарственных препаратов, предварительно включённых в липосомы.

Были приготовлены и использованы липосомальные суспензии: пентоксифиллина, этмозина гидрохлорида (морицизин), пирроксана, кальция хлорида, глутатиона окисленного, сальбутамола и фторурацила в концентрациях, соответствующих среднетерапевтическим для парентерального введения [Машковский М.Д., 1998]. Выбор пал на эти препараты, так как теоретически они позволяют воздействовать на патогенетические механизмы воз-


Таблица 3

Сравнительная характеристика подавления пролиферативой активности культур кератиноцитов при использовании отдельных липосомальных

препаратов (по результатам включения ³Н-тимидина)

Препарат	Поражённый участок (n 8) Имп/мин.	Непоражённый участок (n 8) Имп/мин.	Уменьшение по сравнению с контролем (во сколько раз)
Контроль (до применения липосомальных препаратов)	3178±126	2750±195
Пентоксифиллин	750±85 *	750±100 *	4,2/ 3,6
Этмозин	2530±400	2200±350	1,2/1,2
Селенит натрия	980±20 *	1150±500 *	3,2/2,4
Сальбутамол	1250±180 *	1600±90 *	2,5/1,7
Кальция хлорид	2580±300	2250±200	1,2/1,2
Глутатион (OГ)	1400±100 *	1420±90 *	2,2/1,9
Пирроксан	750±70 *	800±100 *	4,2/3,4
Флуороурацил	3000±250	2500±380	1,0/1,1

*- изменения достоверны по сравнению с контролем (р<0,005)


никших нарушений в кератиноцитах при псориазе за счёт стабилизации метаболического потенциала клетки, окислительно-востановительного статуса, регуляции митотической активности и механизмов апоптоза [Суворов А.П.,1988; Белушкина Н.Н., 1998; Бутов Ю.С. и соавт., 2001; Дмитренко К.В., 2003]. Выбранные лекарственные средства обладают разными механизмами действия. Они хорошо известны и широко применяются парентерально для лечения сердечно-сосудистых, неврологических, аллергических, онкологических и других заболеваний, но в качестве средств для наружной терапии псориаза никогда не применялись.

Наиболее сильным ингибитором пролиферации оказался пентоксифиллин, который уменьшал пролиферативную активность кератиноцитов как из поражённого, так и непоражённого участков кожи более чем в 4,2 и 3,6 раза соответственно. Аналогичная эффективность в ингибировании пролиферации отмечена у пирроксана - в 4,2 и 3,4 раза. Далее следует селенит натрия – в 3,2 и 2,4 раза. Сальбутамол и глутатион окисленный обладали несколько менее выраженным влиянием на пролиферацию – 2,5/1,7 и 2,2/1,9 раза соответственно (р  0,005), (табл.3). Этмозин обладал крайне незначительной активностью, а хлорид кальция и флуороурацил антипролиферативной активностью практически не обладали.


3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на

пролиферацию культур кератиноцитов

С целью создания комбинированного лекарственного средства в форме крема для наружной терапии псориаза проведено исследование антипролиферативного действия смесей лекарственных препаратов, предварительно включённых в липосомы, на культуры кератиноцитов, выращенных от больных псориазом. Комбинированные липосомальные смеси приготавливались из липосомальных суспензий отдельных препаратов, каждый из которых обладает выраженным самостоятельным антипролиферативным эффектом, как было показано ранее. Исследовались комбинации препаратов в различных сочетаниях на культурах выращенных как с пораженных, так и с интактных участков. Смесь № 1 – пентоксифиллин, селенит натрия, пирроксан. Смесь № 2 – пентоксифиллин, этмозин, селенит натрия. Смесь № 3 – пентоксифиллин, селенит натрия, сальбутамол, пирроксан. Смесь № 4 – пентоксифиллин, сальбутамол, пирроксан. Смесь № 5 – пентоксифиллин, селенит натрия.

Результаты полученных исследований позволяют сказать, что пролиферация кератиноцитов в культурах клеток кожи больных псориазом значительно подавлялась (р < 0,001) при использовании всех перечисленных комбинаций, однако наиболее эффективной оказалась смесь № 1, подавлявшая пролиферацию в 36 и 24 раза соответственно. Несколько уступали по активности смеси № 2 и № 3, что составило ингибирование пролиферативной активности в 23,0/18,3 и 22,6/15,0 раз по сравнению с контролем в поражённом/интактном участках кожи соответственно. Из числа исследованных несколько хуже, но достаточно эффективно подавляли рост клеток в культурах смеси №№ 4, 5, что составило 17,1/12,7 и 14,5/11,8 соответственно. При этом, как и в случае с изолированными лекарственными препаратами, захват ³Н-тимидина более активно осуществлялся кератиноцитами поражённых участков, что свидетельствует о более высокой митотической активности этих клеток. Отмечены также существенные различия между смесями в каждой группе (р < 0,05), за исключением №№ 2, 3 в культурах с поражённых участков и №№ 4, 5 в культурах, выращенных из непоражённых клеток (табл. 4).

Из полученных результатов следует, что комбинации из пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана (смесь № 1), а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина (смесь № 2) наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, что вероятно связано с синергичным усилением механизмов подавления пролиферации.

Наибольшую активность проявил пентоксифиллин вероятно потому, что его биологическое действие обусловлено влиянием на Р₁ аденозиновые рецептроры, ингибированием фосфодиэстеразы (ФДЭ), что ведёт к увеличению


Таблица 4

Сравнительная характеристика подавления пролиферативной активности культур кератиноцитов смесями липосомальных препаратов (по результатам включения ³Н-тимидина)

№ смеси	Поражённый участок (n 8) Имп/мин.	Непоражённый участок (n 8) Имп/мин.	Уменьшение по сравнению с контролем (во сколько раз)
Контроль (до применения липосомальных препаратов)	14724±96	12456±40
1	406±32 *, **	518,0±38*, **	36,2/24,0
2	639±24*	681,5±25 *, **	23,0/18,3
3	649±35*	825±34*, **	22,6/15,0
4	859±46 *, **	974,5±27*	17,1/12,7
5	1011±39 *, **	1053±34*	14,5/11,8

*- изменения достоверны по сравнению с контролем (р < 0,001)

**- изменения достоверны внутри группы (p < 0,05)


содержания цАМФ в клетках и проявлению известного антипролиферативного эффекта этого соединения [Машковский М.Д., 1998; Дмитренко К.В., 2002; Voorhees J., 1974]. Достаточно логичным продолжением этого действия является уменьшение концентрации кальмодулина в кератиноцитах, так как этот кальций связывающий белок - одна из субъединиц ФДЭ, и снижение концентрации активированного ионизиованного кальция, через который реализуется действие фосфолипаз, а также секреция ряда хемокинов ведут как к снижению функциональной активности клеток вообще, так и пролиферативной в частности. Один из наиболее важных антипролиферативнвных эффектов пентоксифиллина, на наш взгляд, обусловлен ингибированием продукций фактора некроза опухолей (ФНО-α) [Дмитренко К.В., 2003]. ФНО-α считается одним из главных в процессе развития патохимической, гистоморфологической и клинической картины псориаза, а псориатический кератиноцит – активный продуцент этого цитокина. Являясь фактором активных кератитноцитов, моноцитов и цитотоксических лимфоцитов (Тс1) ФНО-α участвует в повреждении эндотелия [Маркушева Л.И. и соавт., 1996; Шичкин В.П., 1998; Маркушева Л.И. и соавт., 2000; Heymann W.R., 2007]. Т.о. при псориазе эндотелий капилляров сосочкового слоя дермы становится цитокин-генерирующим, вследствие чего инициируется экспрессия молекул клеточной адгезии. Сам эндотелий активно участвует в продукции цитокинов [Gottlieb A.B. et al., 2002; Кrueger J.G., 2002]. Следовательно, подавление пролиферации кератиноцитов может объясняться подавлением продукции ФНО-α в культуре клеток, как одного из главных факторов аутокринной регуляции даже в отсутствие резидентных клеток кожи. В коже больных псориазом при применении липосомального пентоксифиллина выраженный антипролиферативный эффект вероятно также обусловлен влиянием на экспрессию гена ФНО-α, не только в кератиноцитах, но в первую очередь в иммунокомпетентных клетках: КЛ, Тс1 и эндотелии сосудов [Bos J.D., 1999; Кrueger J.G., 2002; Bos J.D., 2007].

Пирроксан, являясь неселективным адреноблокатором, ингибирует пролиферацию благодаря блокированию преимущественно α₂-адренорецепторов. Биохимические механизмы действия α-адреноблокаторов обусловлены ингибированием мембранных клеточных систем аденилатциклаза - цАМФ с последующей модуляцией соответствующих ферментных систем внутри клеток [Машковский М.Д.,1998; Сергеев П.В. и соавт.,1999].

Механизмы действия селенита натрия и его основного биологического компонента селена (Se⁴⁺) на процессы пролиферации кератиноцитов нам практически неизвестны. Есть указания на то, что большие концентрации этого иона подавляют полностью пролиферативно-митотическую активность любых клеток, включая и клетки кожи [Droge W. et al., 1998; Filomeni G. et al., 2005; Jordan P.A. et al., 2006]. Наиболее часто роль данного микроэлемента рассматривается во взаимосвязанных процессах СРО, тиол-дисульфидном обмене и функционировании системы глутатиона [Кулинский В.И. и соавт., 1990; 1993]. Учитывая известные на сегодня данные о селене, теоретически можно предположить, что он должен подавлять пролиферацию и улучшать дифференцировку клеток.

Известно, что селен улучшает процессы клеточного созревания за счёт стабилизации белков, активации тканевого дыхания, поддержания функционально активной формы цитохрома С [Скальный А.В., 2004]. Биологическая значимость селена в организме человека связана с физиологической активностью селен содержащих биологических макромолекул и его низкомолекулярных соединений. Отмечено, что в зависимости от концентраций, действие молекулярного селена на клетки проявляется снижением их митотической активности и удлинением митотического цикла. Кроме того соединения селена способствуют формированию нормального соотношения между клетками иммунной системы; связывают ионы тяжелых металлов, вследствие чего препятствуют их взаимодействию с тиоловыми группами белков и ферментов [Басоло Ф. и соавт., 1971; Isaacs J.et al., 1977]. Вероятно, совокупность данных свойств и привела к получению нами достаточно выраженного антипролиферативного эффекта.

О роли системы глутатиона в метаболизме клеток кожи известно крайне мало. Так как окисленный и восстановленный глутатионы в целом являются участниками окислительно-восстановительной системы любой клетки, донорами сульфгидрильных групп и одними из главных участников антиоксидантной защиты, то, экстраполируясь от известного, можно сказать, что глутатион окисленный стимулирует процессы дифференцировки, смещая редокс-потенциал клетки в сторону окисления [Filomeni, G., 2002]. Это ведёт к появлению протонов, свободных электронов и способствует появлению активных форм кислорода, что ингибирует пролиферативную активность кератиноцитов. ОГ обладает выраженным влиянием на активность многих энзиматичеких систем: снижает активность ферментов синтеза гликогена, гликолиза, холестерина, белков, что ведёт к подавлению митотической активности [Кулинский В.И. и соавт., 1990].

Сальбутамол - β₂-адреномиметик. Оказывает высокоселективное стимулирующие действие на β₂-клеточные аденилатциклазные адренорецепторы, что ведёт к увеличению концентрации цАМФ [Машковский М.Д., 1998]. В результате ожидался яркий антипролиферативный эффект, однако его не получили ни в одном случае. Вероятно, полученный результат связан с недостаточно представленным рецепторным аппаратом на кератиноцитах, и что более вероятно, ограниченными возможностями клеток кожи, изолированных в культуре к наработке большого количества АТФ. Поэтому, в данном случае более эффективными оказываются те лиганды, которые сохраняют цАМФ от использвания за счёт блокады ФДЭ (пентоксифиллин), чем те, которые стимулируют его выработку из АТФ (сальбутамол).

Этмозин (этмозина гидрохлорид) является производным фенотиазина и относится к фармакологической группе препаратов-антиаритмиков I класса. Используется для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие за счёт подавления транспорта ионов натрия через «быстрые» натриевые каналы клеточной мембраны, что ведёт к снижению активности ферментов, участвующих в репликации ДНК, и в итоге, к снижению пролиферативной активности; снижает интенсивность поступления кальция в клетку, подавляя при этом активацию фосфолипаз, тем самым, вызывая противовоспалительный и антигистаминный эффект за счёт ингибирования липооксигеназной ферментной системы - продуцента лейкотриенов – медиаторов воспаления. [Шарапова Г.Я. и соавт., 1989; Машковский М.Д., 1998]. Применение этмозина не дало желаемого антипролиферативного эффекта в культурах кератиноцитов при его испытании как отдельно взятого препарата в липосомальной форме.

Практически аналогичная картина была отмечена при применении кальция хлорида и фторурацила. Применяемые парентерально препараты кальция оказывают свой лечебный эффект за счёт стимуляции как коркового, так и мозгового вещества надпочечников. Резкое повышение концентрации данного катиона в крови ведёт к выбросу катехоламинов, и что особенно важно - глюкокортикоидов. Как следствие – выраженный противовоспалительный и антипролиферативный эффекты. Применение препаратов кальция в виде добавления к культуре клеток таким действием не обладает.

Флуороурацил (5-фторурацил), ингибируя фермент тимидилатсинтазу, нарушает синтез ДНК и РНК [Машковский М.Д.,1998]. Именно от данного соединения мы ожидали наиболее выраженного эффекта. Тем более, что цитостатики являются часто и успешно применяемыми в схемах лечения псориаза. Лечебное действие данного препарата, возможно, обусловлено только его иммуносупрессивными свойствами.

Таким образом, результаты исследований показали, что некоторые из использованных препаратов целесообразно применять в липосомальной форме в составе наружных средств для лечения вульгарного псориаза.

В каждую из составленных комбинаций входил пентоксифиллин как обязательный компонент с наиболее выраженным антипролиферативным эффектом. Как ни странно, в составе комбинации хорошие результаты получены с использованием этмозина, который не показал индивидуальной антипролиферативной активности в отношении культур клеток. Доказательством синергичного действия препаратов является сравнительный анализ между смесями № 2 и № 5, которые отличаются только отсутствием этмозина, но при этом № 5 подавляет пролиферацию почти в 2 раза хуже, не смотря на присутствие селенита натрия.

Анализ полученных результатов видимо позволяет сказать, что антипролиферативная активность комбинаций липосомальных лекарственных препаратов наиболее выражена там, где не осуществлялось прямого воздействия на выработку цАМФ и следовательно, на энергетический статус достаточно изолированной клеточной системы. Так, смесь № 3 отличалась от № 1 наличием сальбутамола, что теоретически должно было усилить антипролиферативный эффект, однако он оказался хуже в 1,6 раза во всех группах наблюдения. Так же наличие сальбутамола в смеси № 4 при отсутствии селенита натрия ещё более ухудшило результат, что видимо, можно объяснить как отсутствием комплексного стабилизирующего действия селена на обмен белков и тканевое дыхание, так и цитостатическим эффектом данного соединения. Не исключено, что в данных условиях этот катион можно рассматривать как фактор прооксидантной системы, способствующий генерации АФК.

Результаты исследований влияния липосомальных лекарственных препаратов и их комбинаций, проведенных с использованием клеточных культур кератиноцитов показали, что:

- культуры кератиноцитов, выращенные из поражённых и непоражённых участков кожи больных псориазом обладают высокой митотической активностью и способны долгое время пролиферировать без добавления специальных ростовых факторов;

- пролиферативная активность культур кератиноцитов, выращенных с поражённых и непоражённых участков кожи, практически не отличается друг от друга;

- самоподдержание культуры кератиноцитов в среде, лишенной фактора роста, свидетельствует о том, что одно (или несколько) биологически активных веществ, стимулирующих пролиферацию клеток, продуцируется самими кератиноцитами;

- Са²⁺ не оказывает прямого антипролиферативного действия, а его терапевтическая эффективность вероятно обусловлена опосредованным влиянием через другие органы и системы (надпочечники, нервная, иммунная, сердечно-сосудистая системы и.т.д.);

- флуороурацил не проявляет прямого цитостатического эффекта к пролиферирующим кератиноцитам, поэтому применение цитостатиков при неосложненных формах псориаза, по-видимому, не оправдано, а их лечебное действие скорее всего обусловлено только иммуносупрессивными свойствами;

- наиболее ярким антипролиферативным действием обладают пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол (в порядке убывания), предварительно заключённые в лиосомальную форму;

- комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина наиболее целесообразны для использования в наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом;

- лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов больного псориазом к различным препаратам и их смесям, может быть использован не только для тестирования лекарств, влияющих на эпидермис, но и для изучения пролиферативно-дифференцировочных процессов кожи с последующим созданием новых лекарственных препаратов с целью индивидуализации и оптимизации наружной терапии.


Состояние системы свободнорадикального окисления и

антиоксидантной защиты в культурах кератиноцитов больных

псориазом

0. 1. Состояние систем СРО и АОЗ культур до воздействия
   

липосомальными препаратами

Результаты представленные, в табл. 5, свидетельствуют о значительных изменениях состояния системы свободно-радикального окисления в культурах кератиноцитов, полученных и выращенных от больных псориазом. Прежде всего, отмечается резкое угнетение прооксидантной системы, о чём свидетельствуют результаты концентраций диеновых коньюгатов и малонового диальдегида по сравнению со здоровыми людьми. Эти показатели на пике пролиферации уменьшены по сравнению с нормой более, чем в 2 раза. (табл.5). При этом многие аналиты, характеризующие антиоксидантную систему в период активной пролиферации кератиноцитов, повышены, причём это касается как ферментов антиоксидантной защиты, так и субстратов. Мы считаем, что данные изменения свидетельствуют об изменении редокс-потенциала клеток в сторону восстановления и превалировании процессов биосинтеза над процессами катаболизма.

Изменения ферментов, обеспечивающих функционирование системы глутатиона, не подверглись столь значительным изменениям. (табл. 5). Наряду с ферментами системы глутатиона, активность ферментов, принимающих участие в дисмутации активных форм кислорода (АФК) и перекиси водорода, образующихся в процессах СРО в больших количествах, изменилась

Таблица 5

Влияние отдельных липосомальных препаратов на системы СРО и АОЗ

культур кератиноцитов больных псориазом

Показатель	Контроль (n 8)	До воздействия (n 8)	После воздействия липосомальными препаратами на культуры кератиноцитов
			Пентоксифиллин (n 8)	Пирроксан (n 8)	Селенит натрия (n8)	Сальбутамол (n 8)
ДК (нмоль/г ткани)	68,16± 9,74	33,25±5,42*	74,25±6,48**	69,4±4,35**	52,7±5,79 **	64,2±3,49 **
МДА (нмоль/г ткани)	162,8±5,4	78,2±3,21*	136,4±3,65**	126,8±4,21**	144,5±3,58**	99,3±3,71**
ВГ (ммоль/г ткани)	3,46±0,21	11,23±1,22*	3,73±0,55**	3,58±0,34**	5,33±0,22***	8,91±0,31*
СГ (ммоль/г ткани)	10,34±0,33	34,7±2,34*	15,87±1,29* , **	18,9±2,51*, **	24,6±2,12*, **	28,3±2,81**
ГР (мкмоль/(мин·г белка)	96,12± 6,85	121±5,28 * (p<0,05)	101±5,33 **	104±5,76 **	93,4±4,65 **	118,7±5,87
ГП (ммоль/(мин·г белка)	2,34± 0,56	2,21±0,11	3,53±0,13 *, **	2,39±0,24	3,91±0,31 *, **	2,64±0,58
СОД (мкмоль/(мин·г белка)	188,8±16,1	275,4±13,3 *	233,8±12,3 **	205,7±16,9**	271±15,5 *	240,6±12,8*, **
Каталаза мкмоль/(мин·г белка)	36,72± 4,86	24,13±1,97*	47,0±4,08 *, **	35,22±2,26**	44,56±3,76 * , **	28,32±2,31*
ОАА (%)	36,72± 4,86	71,4±4,25*	41,4±3,86**	44,2±3,78 **	47,6±3,65**	67,3±4,58*
Гл-6ф-ДГ (мкмоль/(мин·г белка)	34,19± 4,22	52,7±4,13*	33,2±5,01**	30,8±4,65**	35,7±4,27 **	34,2±4,29**

*- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,001);

** - различия достоверны с результатами до воздействия (p<0,05)


более значительно. Уровень общей антиокислительной активности (ОАА) кератиноцитов в период активной пролиферации, как суммарный показатель, оказался ожидаемо высоким. Он превышал контрольную норму практически в 2 раза (р <0,05). Особое внимание обращает на себя поведение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. В наших исследованиях его активность увеличена на 54 % по сравнению с кожей здоровых людей. Полученные данные, прежде всего, свидетельствуют о высокой метаболической активности пролиферирующих кератиноцитов, что подтверждается не только высокой активностью Гл-6ф-ДГ, участвующей в прямом окислении глюкозы, но и в целом относительно спокойным поведением ферментов антиокислительной защиты. На наш взгляд, такое поведение системы свободнорадикального окисления может быть обусловлено изменённым редокс-потенциалом клеток, смещенным в сторону восстановления и поддерживающим высокую белковосинтетическую функцию кератиноцитов в период активной пролиферации.


2. Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на состояние

систем СРО и АОЗ культур кератиноцитов больных псориазом

После воздействия отдельных липосомальных форм на активно пролиферирующие клетки отмечена в целом обратная зависимость изменений системы СРО и АОЗ (табл.5). Аналогично концентрации ДК, достоверно значимо изменялось содержание малонового диальдегида – одного их конечных метаболитов ПОЛ. Однако наиболее высокие концентрации МДА нами были получены в культурах после внесения липосомального селенита натрия. Уровень МДА в 1,8 раза превысил его концентрации над тем, что был в клетках в период активной пролиферации. После воздействия пентоксифиллина уровень МДА увеличился в 1,7 раза, пирроксана в 1,62, а сальбутамола только в 1,26 раза, во всех случаях - (р<0,001). Ни в одном из наблюдений уровень данного показателя не достиг значений группы контроля.

Метаболиты и ряд ферментов антиоксидантной системы, напротив, имели обратную динамику. Так, при внесении в культуры пентоксифиллина и пирроксана концентрации восстановленного глутатиона практически нормализовались до значений 3,73±0,55 и 3,58±0,34 ммоль/г ткани соответственно и не отличались от уровня этого метаболита в здоровой коже, при этом оказавшись ниже концентраций в активно пролиферирующих кератиноцитах в 3 раза (р<0,001).

Аналогичным образом претерпела изменения концентрация сульфгидрильных групп в исследуемых культурах. В кератиноцитах под действием пентоксифиллина она уменьшилась с 34,7±2,34 до 15,87±1,29 ммоль/г ткани, т.е. в 2,2 раза. Следует также отметить, что ни в одном из наблюдений концентрация СГ не снизилась до значений контрольной группы, превышая её в наилучшем случае на 35 %.

Глутатионредуктаза показала наибольшее снижение активности по сравнению с периодом активной пролиферации после применения селенита натрия на 33 %, что соответствовало значениям контрольной группы. Напротив, поведение селен-зависимой глутатионпероксидазы было несколько иным. При внесении в среду пентоксифиллина активность фермента резко возросла на 60 % по сравнению с периодом активной пролиферации и на 50 % по отношению к значениям контрольной группы. Под действием селенита натрия активность фермента претерпела наиболее значимые изменения. Увеличилась на 77 % по отношению к периоду пролиферации и на 66 % превысила значения группы контроля.

Активность супероксиддисмутазы наиболее выражено снижалась после применения пирроксана и пентоксифиллина в культуре кератиноцитов – на 25,3% и 15 % соответственно. Напротив, активность каталазы в культурах клеток имела выраженные тенденции к росту. Внесение липосомальных пентоксифиллина и селенита натрия привело к повышению активности этого гемохромопротеина в 2 и 1,8 раза по сравнению со значениями в период пролиферации и в 1,3 и 1,2 раза по сравнению с культурами, использованными в качестве контрольных соответственно (табл.5).

Общая тенденция в поведении антиокислительной клеточной системы наиболее отчётливо прослеживается в изменениях показателя общей антиокислительной активности. В среднем, уменьшение ОАА по сравнению с периодом наивысшей пролиферативной активности составило 1,7 раза.

Все использованные липосомальные препараты вызвали значительное подавление активности Гл-6ф-ДГ. Так, после введения в культуру активно пролиферирующих клеток пирроксана ее активность снизилась наиболее значительно и составила 58 % от значений контроля. Натрия селенит, сальбутамол и пентоксифилин подавляли активность на 33 %, 35 % и 37 % соответственно. Во всех случаях активность основного фермента пентозофосфатного цикла не отличалась от значений контрольной группы (табл. 5).

Изменения, отмеченные нами в культурах кератиноцитов после применения липосомальных препаратов, обладающих регуляторной активностью на процессы пролиферации и метаболизма, трудно поддаются однозначной трактовке, несмотря на ряд отчётливо прослеживаемых тенденций. Отмечено, что наиболее выраженные изменения, вызывал пентоксифиллин. Неселективный α-адреноблокатор – пирроксан, отстал от него крайне незначительно. На наш взгляд, это можно объяснить единой концепцией конечного влияния на регуляторные системы клеток через системы вторичных посредников. И тот, и другой препарат являются цАМФ и АТФ сберегающими. Только пентоксифиллин делает это, блокируя фосфодиэстеразы, а пирроксан – прикрывая постсинаптические рецепторы на мембранах клеток. Напротив, сальбутамол – β-адреномиметик, активирует аделнилатциклазу с последующим синтезом цАМФ из АТФ, что должно приводить к ожидаемым антипролиферативным эффектам, что мы и наблюдали в ряде случаев. Однако из всех наблюдений, изменения, происходящие под влиянием этого соединения, оказались наименее выраженными. Под влиянием сальбутамола значимо увеличивалась концентрация ДК и МДА, а также снижалась активность СОД.

Также отмечено, что полученные изменения подтвердили общую закономерность в поведении системы СРО при псориазе, которая ранее упоминалась в работах отдельных авторов [Хышиктуев Б.С. и соавт., 2000; Шилов В.Н. и соавт., 2000; Шинин В.В. и соавт., 2002]. Активно пролиферирующие псориатические кератиноциты обладают высокой степенью антиокислительной активности, о чём свидетельствует как низкая концентрация продуктов ПОЛ (ДК, МДА), так и высокий уровень метаболитов и активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты. Применяемые препараты оказывали выраженное влияние на пролиферацию, а, следовательно, и на дифференцировку клеток кожи, при этом изменялись показатели, характеризующие поведение про-антиоксидантной систем, а значит и окислительно-восстановительного статуса и энергетического метаболизма клеток. Сейчас, мы можем с уверенностью сказать, что полученные и наблюдаемые нами изменения предшествовали снижению пролиферации и уменьшению клеточного пула в культуре. Следовательно, вначале метаболизм, а затем морфологические проявления.

Полученные результаты позволяют сказать, что подавление пролиферации вводимыми в культуральную среду липосомальными препаратами, сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления, о чём свидетельствуют увеличенные концентрации ДК, МДА, падение значений ОАА.

В период активной пролиферации кератиноциты содержали высокий уровень ВГ. На наш взгляд это вполне логично. Мы знаем, что за счет превращения восстановленной формы глутатиона в окисленную эта система принимает ведущее участие в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в тканях [Кулинский В.И.,1990], необходимого для осуществления таких процессов жизнедеятельности клеток, как работа мембранных структур, деятельность цитоскелета, клеточное деление, регуляция активности гормонов пептидной природы [Cotgreave I.A. et al., 1998; Ghibelli L. Et al., 1999; Filomeni G., 2002]. В нашем случае все перечисленное необходимо для ускоренной пролиферации и успешного клеточного деления, для обеспечения активной белковосинтетической функции, что и отмечается при псориазе [Беляев Г.М. и соавт., 2005; Goldberg N., 1974; Roenigk H.H. et al., 1999]. Следовательно, высокий уровень ВГ может свидетельствовать о подержании высокого восстановительного потенциала, что дополнительно подтверждается высокой концентрацией сульфгидрильных групп, отмеченной во всех культурах на пике пролиферации и уменьшением содержания этого показателя параллельно со снижением концентраций ВГ при внесении в культуральную среду липосомальных препаратов. При падении концентраций глутатиона клетка меняет свой восстановленный статус на окисленный, что характеризуется интенсификацией ПОЛ.

Снижение концентрации ВГ в клетках связано с работой мембранной γ-глутамилтранспептидазы (γ-ГТП) и цАМФ зависимых протеинкиназных механизмов. Рост содержания цАМФ в тканях вызывает снижение активности γ-ГТП и повышение внутриклеточной концентрации ВГ [Корнеев А.А. и соавт., 1993]. Следовательно, в нашем случае при действии пентоксифиллина и сальбутамола концентрация ВГ должна расти, а она почти во всех случаях достоверно падает, что объяснить на первый взгляд достаточно трудно. Можно предположить, что количество β-адренергических рецепторов на псориатических кератиноцитах генетически снижено, что косвенно подтверждается их слабой реакцией на сальбутамол. В случае действия пентоксифиллина на культуры клеток можно сказать, что действие цАМФ-зависимых протеинкиназных механизмов на регуляцию концентрации ВГ неоднозначно, и видимо не только от них зависит изменение уровня этого трипептида в клетках. Об этом, например, свидетельствуют данные, полученные при действии селенита натрия и пирроксана, которые не имеют прямого отношения к регуляции цАМФ. Пролиферирующий кератиноцит нуждается в аминокислотах, возможно, этим и объясняется достоверно высокий уровень этого метаболита даже в условиях подавления пролиферативной активности.

Se-зависимая глутатионпероксидаза - фермент, который в ходе выполнения своих функций осуществляет обратимое окисление восстановленной формы глутатиона в окисленный (ОГ), а также принимает участие в антиоксидантной защите и регуляции тиол-дисульфидного равновесия в тканях. Активация фермента осуществляется цАМФ-зависимой протеинкиназой [Колесниченко Л.С. и соавт.,1987;1989; Isaacs J.et al., 1977]. Наиболее выраженное повышение активности фермента при добавлении в среду натрия селенита вероятно связано с его активирующим влиянием на этот фермент. Известно, что дефицит селена приводит к снижению активности ГП более чем в 65 раз [Кулинский В.И. и соавт., 1993]. Однако существуют данные, свидетельствующие о том, что неорганический селен не включается в состав данного фермента [Flohe L., 1978]. Избыток, как и недостаток селена, подавляет активность этого фермента. Повышение активности ГП после воздействия пентоксифиллина отчётливо свидетельствует об увеличении уровня цАМФ в клетке, коррелирует с падением концентрации ВГ и повышением антипролиферативного потенциала. Рост активности ГП при интенсификации ПОЛ является компенсаторным и может быть связан с необходимостью утилизации различных видов перекисей, которые образуются в избытке в этот период. Кроме того, активация ПОЛ ещё не говорит о повышении концентрации АФК и самого кислорода, т.к. известно, что снижение концентрации кислорода также как и его избыток ведут активизации процессов СРО [Владимиров Ю.А. и соавт., 1972; Зозуля Ю.А. и соавт., 2000].

Глутатионредуктаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. В наших наблюдениях ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, причём ГР теряет активность в большей степени.

Активность ГР регулируется цАМФ-зависимым механизмом [Кулинский В.И. и соавт., 1990; Isaacs J.et al., 1977] и зависит также от состояния ее SH-групп, поэтому при физиологических концентрациях ВГ оказывает ингибирующее влияние на фермент [Latta K. et al., 1984; Mannervik B., 1987; Chang S.W. et al., 1989]. Следовательно, при низких концентрациях ВГ активность фермента должна компенсаторно расти, а в наших наблюдениях при внесении липосомальных пирроксана, сальбутмола и натрия селенита она падает.

Мы знаем, что скорость НАДФ·Н-зависимого восстановления окисленного глутатиона в ВГ под действием глутатион-редуктазы (ГР) намного превосходит возможности его синтеза de novo в тканях [Кулинский В.И. и соавт., 1990; De Almeida A., 1989]. Необходимым условием для осуществления глутатионредуктазной реакции является наличие в тканях достаточного уровня НАДФ·Н, так как его расходование при этом в 6 раз выше, чем на биосинтез жирных кислот и обеспечение процессов микросомального окисления [Уайт А., 1981]. Основным источником восстановленной формы НАДФ является ключевая реакция пентозофосфатного пути метаболизма углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная, которая и лимитирует возможности редокс-циклирования глутатиона [Тиунов Л.А., 1988; Tate S.S. et al.,1985]. В наших исследованиях активность Гл-6ф-ДГ достоверно снижена под влиянием всех вводимых препаратов, что может свидетельствовать об ингибировании механизма восстановления глутатиона вследствие недостаточного количества восстановленного НАДФ. Этим можно объяснить низкий уровень ВГ во всех группах наблюдения после воздействия липосомальных лекарственных препаратов. С другой стороны, активность данного энзима может быть подавлена возросшим прооксидантным статусом и окислением сульфгидрильных групп ГР. Это подтверждается и данными, свидетельствующими о том, что оксидативное повреждение тканей Н₂О₂ развивается при дефиците глутатиона и ГП [Flohe L. 1982; Simmons Th.W., 1988].

Доказано, что активность основного фермента антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД), прогрессивно уменьшается с увеличением степени тяжести повреждения клеток и развития гипоксии. Возможно, угнетение активности СОД развивается по механизму обратной связи - ингибирование избытком субстрата, являющегося, в свою очередь, продуктом ксантиноксидазной и пероксидазной реакций. Таким субстратом являются супероксидный анион-радикал и перекись водорода. В нашем случае возрастание их концентраций в системе можно предположить с большой долей вероятности, так как на фоне увеличения активности ГП, каталазы и роста концентраций продуктов ПОЛ накопление перекисей и АФК вполне очевидно. Рост активности каталазы, вероятно является временным и имеет в основном компенсаторный характер в связи с увеличением концентраций Н₂О₂ во внутриклеточной среде.

Мы считаем, что полученные нами изменения в системе СРО и глутатиона во многом обусловлены тем, что кератиноцит с приостановленной пролиферативной активностью готовится к вступлению в апоптоз, а значит к последующей гибели. Кроме того, нельзя не учесть, что кератиноциты, живущие в культуре, к которой экстраполяция процессов, хорошо описанных для тканей внутренних органов, изъятых у животных в ходе эксперимента, не всегда в полной мере подходит.

3. Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на про- и

антиоксидантную активность культур кератиноцитов

Для оценки состояния системы СРО в культурах кератиноцитов мы провели определение её параметров после воздействия комбинациями липосомальных препаратов, состоящих из пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита (смесь № 1) – как наиболее активной и пентоксифиллина и натрия селенита (смесь № 5) – как наименее подавляющей пролиферацию. Таким образом, было создано 2 группы клеточных культур, в одну из которых добавлялась липосомальная смесь № 1, в другую – смесь № 5. Результаты исследований представлены в табл. 6.


Таблица 6

Влияние комбинаций липосомальных препаратов на системы СРО и АОЗ

культур кератиноцитов больных псориазом

Показатель	Контроль	До воздействия (n 8)	После воздействия липосомальными препаратами на культуру кератиноцитов
			Пентоксифиллин Пирроксан Селенит натрия №1 (n 8)	Пентоксифиллин Селенит натрия №5 (n 8)
ДК (нмоль/г ткани)	68,16± 9,74	27,65±5,79*	84,28±3,49**	79,16±4,19**
МДА (нмоль/г ткани)	162,8±5,4	62,16±5,33*	195,52±6,25**	188,44±4,87**
ВГ (моль/г ткани)	3,46±0,21	15,28±1,87*	2,87±0,24**	2,73±0,92**
СГ (ммоль/г ткани)	10,34±0,33	22,76±1,36*	6,33±1,86**	7,24±0,87**
ГР (мкмоль/(мин·г белка)	96,12± 6,85	111,67±5,72	84,76±4,36**	89,24±4,61**
ГП (ммоль/(мин·г белка)	2,34± 0,56	2,13±0,12	3,47±0,22* ** (p<0,05)	3,21±0,31**
СОД (мкмоль/(мин·г белка)	188,8±16,1	296,43±19,3*	208,18±15,3**	237,53±13,5**
Каталаза мкмоль/(мин·г белка)	36,72± 4,86	19,27±1,97* (p<0,05)	44,0±4,08 **	38,12±3,16**
ОАА (%)	36,72± 4,86	73,45±4,16*	33,29±3,87**	41,25±5,19**
Гл-6ф-ДГ (мкмоль/(мин·г белка)	34,19± 4,22	61,76±4,74*	24,72±2,95**	27,82±4,65**

*- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0.001);

** - различия достоверны с результатами до воздействия (p<0,05)


Сопоставляя данные, полученные в обеих группах наблюдений с отдельными липосомальными препаратами и их комбинациями, хочется отметить единую тенденцию в поведении системы антирадикальной защиты и ПОЛ в их изменениях, при этом по многим показателям изменения, полученные при действии смесей препаратов, более значительны.

В первую очередь это проявляется в активации свободно-радикальных процессов по результатам ДК и МДА, которые значительно превалируют под

влиянием лекарственных комбинаций, чем отдельных препаратов.

Также более значимым было падение концентраций ВГ и сульфгидрильных групп после применения липосомальных смесей. Динамика изменений остальных показателей как после применения смесей, так и отдельных препаратов различий не имела.

В целом следует также отметить, что изменения, происходившие в системе свободнорадикального окиления и АОЗ кератиноцитов, оказались более значимыми под влиянием липосомальных комбинаций и особенно № 1, что совершенно чётко коррелирует с данными, полученными при радиометрическом измерении пролиферативной активности, и клиническими данными, полученными при применении у больных препарата Липсор, изготовленного на базе именно этой антипролиферативной комбинации как наиболее эффективной.

Так как полученные результаты достаточно трудно поддаются трактовке и метаболические изменения, под влиянием липосомальных препаратов и их комбинаций не укладываются в цепь стандартных и хорошо известных биохимическиих превращений, способных пояснить механизмы поведения систем СРО и АОЗ. Мы сделали попытку подойти к объяснению полученных результатов с иных позиций.

Одной из важнейших составляющих псориаза как патологического процесса, является подавление дифференцировки кератиноцитов. При этом клетки сохраняют способность дифференцироваться, однако это требует дополнительного воздействия, которым может быть и внешний фактор в виде средств терапии в их числе и те, которые усиливают окислительное давление [Filomeni G. et al., 2002; 2005]. Иными словами, кератиноциты при псориазе располагают комплексом регуляторных и метаболических возможностей для дифференцировки, однако в определенных условиях не способны или ограниченно способны к их инициации. В этой связи закономерным является вопрос о содержании молекулярных механизмов ингибирования дифференцировки кератиноцитов и возможности воздействия на них.

Окислительно-восстановительное состояние клетки – баланс между эквивалентными уровнями окисления и восстановления. Определяется суммарным соотношением концентраций восстанавливающих и окисляющих агентов. При этом система главного редокс-буфера – глутатиона моделирует ответ клетки на окислительно-восстановительные изменения, вызванные внешними или внутриклеточными стимулами [Buuke T.M. et al., 1994; Wang X. et al., 1998]. Внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние определено вкладом различных окислительно-восстановительных пар (редокс-пар). Каждая пара способна обменивать электроны таким образом, что может представлять необходимые в каждом конкретном случае кофакторы в окислительно-восстановительных ферментативных реакциях. Относительное количество восстановленной и окисленной формы каждой пары может определять изменения в клеточном окислительно-восстановительном состоянии, смещая его как в одну, так и в другую сторону [Filomeni G. et al., 2002]. В клетках, включая и кератиноциты существуют три самых важных окислительно-восстановительные системы: никотинамидадениндинуклеотидфосфатная (НАДФН/НАДФ+), тиоредоксиновая (TRXred/TRXox) и глутатиона (ВГ/ОГ). Среди них, последняя является самой важной, так как концентрация глутатиона приблизительно в 500 – 1000 раз выше, чем TRX и НАДФН [Кулинский В.И. и соавт., 1990]. Таким образом, изменения в ВГ/ОГ буфере глутатиона непосредственно отражают внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние и его изменения.

Одно из возможных объяснений схожего действия различных по химической природе и фармакологической активности соединений, содержащих азот, окси- и гидрокси- группы, может быть связано с их способностью образовывать комплексные координационные соединения (КС) с переходными биометаллами (железо, медь и некоторые др.), обладающими способностью в ультра малых количествах в присутствии кислорода и его производных или активных форм азота катализировать окислительные реакции в физиологических условиях [Басоло Ф., 1971; Костромина Н.А. и соавт., 1990]. В этом аспекте объяснимы эффекты селенита натрия, который способен координироваться с эндогенными азот- и серосодержащими органическими молекулами в комплексное соединение с каталитическим действием. Лигандом для селена может выступать молекула ВГ, комплексные соединения которой катализируют окислительно-восстановительные процессы.

Не исключено, что каталитическая активность координационных соединений приводила к снижению уровня восстановительных эквивалентов в цитозоле и, соответственно их экспорта в микроокружение клетки. Наличием подобного действия препаратов в составе липосом можно объяснить характер изменения прооксидантных процессов, а именно активацию СРО, приводящую в итоге к увеличению концентрации ДК и МДА. Мягкое окислительное воздействие на сульфгидрильные группы изучаемых внутриклеточных ферментов также объясняет изменение их активности.

Увеличение окислительной активности в цитозоле приводит к снижению уровня внутриклеточной концентрации ВГ. Так, в период активной пролиферации он достаточно высок. Величина снижения концентрации ВГ при каталитическом действии ультра малых концентраций координационных соединений лекарственных препаратов, введенных в составе липосом, вероятно определяется стабильностью образующихся (КС). Так, пентоксифиллин, способный образовывать более устойчивые КС, будет обладать более сильным действием на уровень ВГ. Пирроксан в совокупности с селенитом натрия значительно усиливают его действие. Особенности влияний селенита натрия обусловлены молекулярной массой координируемых молекул, возможностью их перемещения в различные клеточные компартменты, его возможным непосредственным воздействием на активность селен-зависимых ферментов.

ГР и Гл-6ф-ДГ являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. Установлено, что ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, что может быть объяснено окислительной модификацией сульфгидрильных групп с участием КС, образуемых вводимыми лекарственными препаратами.

При воздействии окислительных стимулов отношение ВГ/ОГ имеет тенденцию к уменьшению, однако, в ответ на окислительное напряжение, глутатион поддерживает окислительно-восстановительное состояние клетки через различные механизмы. Так, активность ГР должна увеличиваться, или избыток ОГ, сформированный в ответ на атаку окислительных эквивалентов, должен быть вытеснен во внеклеточную среду. В наших исследованиях отмечено падение активности ГР, что вероятно связано с механизмами ингибирования этого энзима, каким образом это происходит пока не ясно. В тех случаях, когда окислительное напряжение становится длительным и массивным, а клеточные системы более не способны противодействовать генетически установленным для них дозам АФК, вероятно, как в случае воздействия пентоксифиллином и пирроксаном, количество ВГ уменьшается, что приводит к остановке пролиферации и последующему запуску апоптоза клетки. Уменьшение содержания ВГ считается доказанным звеном запуска митохондриально-зависимымых апоптотических сигнальных путей [Ghibelli L. et al., 1999].

Химическое и физическое воздействие (УФО, лекарственные препараты) или взаимодействие лиганд/рецептор – лишь некоторые из процессов, в которых окислительное напряжение должно быть фактором трансдукции, приводящим к апоптозу, пролиферации, дифференцировке и регуляции клеточного цикла. Доказано, что АФК являются посредниками в передаче клеточных сигналов. Ряд исследователей выдвигали гипотезу относительно роли окислительно-восстановительного состояния окружающей среды в регуляции многих сигнальных путей [Buuke T.M. et al., 1994; Schulze-Osthoff K. et al., 1998].

Окисление, приводящее к истощению ВГ, вызывает формирование межмолекулярных дисульфидов, что приводит к конформационным изменениям, увеличивающим сродство и специфику глутаматного участка ОГ к различным лигандам. Такие изменения способствуют увеличению чувствительности рецепторного аппарата клетки, который может быть заблокирован при излишней восстановленности как наружной, так и внутриклеточной среды псориатичесого кератиноцита [282, 316]. Этим можно объяснить эффективность действия препаратов и методов лечения, которые смещают редокс-потенциал в сторону окисления.

Активные молекулы, способные изменять окислительно-восстановительный фон, непосредственно изменяют внутриклеточную среду, входя в клетку и действуя на функциональные белки. Известно, что взаимодействие лиганд/рецептор вызывает клеточный ответ по механизму, который может произвести активацию нескольких процессов без прямой коммуникации с внутренней частью клетки [Filomeni G.et al., 2002]. Следовательно, тиол/дисульфидный обмен может быть представлен как новый способ преобразования и передачи сигналов из внеклеточной среды до внутриклеточных процессов и отдельных реакций. С этой точки зрения тиол-содержащие молекулы могут быть сигнальными, когда акт передачи происходит на определенных трансмембранных белках. С другой стороны, богатые цистеином мембранные белки могут представлять предполагаемые рецепторы, особенно если они вовлечены в активацию некоторых известных путей трансдукции сигнала [Cotgreave I.A.et al., 1998]. Известно, что десенситизация поверхностно-клеточных рецепторов, в числе прочих причин, может быть обусловлена избыточной восстановленностью среды, формируемой за счет экспорта восстановительных эквивалентов из клеток в свое микроокружение [Filomeni G.et al., 2002]. С участием этих соединений осуществляется процесс восстановления дисульфидных связей целого ряда поверхностно-клеточных рецепторов. Рецептор при отсутствии дисульфидных сшивок приобретает функционально неактивную конформацию, что означает неспособность клеток физиологически адекватно отвечать на регуляторные внеклеточные воздействия [Schulze-Osthoff K. et al., 1998].

Таким образом, обобщенные данные могут предложить новый подход в объяснении действия внеклеточного окислительно-восстановительного фона и передаче клетке различных сигналов, влияющих, в том числе, на её цикл. Внеклеточный окислительно-восстановительный фон ведёт к возникновению перекрестных связей с клеточными рецепторными системами и вызывает ответ по механизмам, которые не являются основными, но используют прямое действие окислительно-восстановительных эквивалентов во внутриклеточных процессах. В частности, внеклеточные окислительно-восстановительные сигналы могут действовать через системы вторичных посредников, которые в свою очередь могут быть представлены или трансмембранными богатыми цистеином рецепторами или специализированными низкомолекулярными веществами.

Результаты, полученные при изучении процессов СРО и АОЗ в культурах кератиноцитов до и после воздействия различных молекулярных комбинаций свидетельствуют о том, что:

- состотояние гиперпролиферации кератиноцитов сопровождается резким угнетением процессов ПОЛ и высоким уровнем антиокислительной активности клеток, о чем свидетельствует низкая концентрация продуктов СРО: ДК и МДА, высокий уровень восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп, а также уровень активности ферментов, участвующих в регуляции антиокислительной защиты;

- угнетение клеточной пролиферации характеризуется резким возрастанием прооксидантного статуса и угнетением АОЗ культур эпидермальных кератиноцитов;

- процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты принимают самое непосредственное участие в регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности клеток кожи при псориазе таким образом, что увеличение интенсивности СРО ведёт к остановке пролиферации, а высокий уровень АОЗ ее поддерживает.

Клиническое исследование

1. Результаты изучения клинической эффективности липосомального крема

Липсор на течение вульгарного псориаза в различных группах больных

в стационарных условиях.

На основе выбранной комбинации в наибольшей степени подавляющей пролиферацию из пентоксифиллина, пирроксана и селенита натрия был создан липосомальный крем для наружной терапии псориаза, получивший авторское название Липсор.

Результаты изучения препарата в стационарных условиях показали, что полная клиническая ремиссия была достигнута у 388 (67%) больных, значительное улучшение у 116 (20%), незначительное улучшение у 40 (7%) и без изменений у 35 (6%) пациентов. Изменение индекса PASI в сторону улучшения отмечалось у 502 стационарных больных (86,6%): в 4,5 раза – у больных с ограниченным псориазом и более чем в 2,6 раза - у больных с распространёнными формами болезни (2 раза – у больных с распространённым псориазом; в 6 раз – у больных с экссудативным псориазом; в 3,5 раза - у больных с диффузным псориазом) (рис.9). Отсутствие эффекта отмечалось у нескольких больных, страдающих, как правило, диффузным псориазом с торпидным течением, незначительное улучшение от применения крема отмечалось у больных с ограниченным экссудативным псориазом, с длительным сроком лечения - от 10 и более лет (табл. 7).