Биологические и эпидемиологические эффекты облучения в малых дозах

Вид материала

Документы

Содержание 3. Многоступенчатый процесс канцерогенеза и модели радиационного канцерогенеза 4. Онкогены и гены-супрессоры опухолей 5. Эффективность репарации днк 6. Роль радиационно-индуцированной нестабильности генома

Подобный материал:

• Эффекты облучения в твердых телах, 247.82kb.
• Алкоголь… Практически все мы употребляем алкоголь, кто-то очень редко, исключительно, 78.97kb.
• Статья Общие положения > Настоящие Требования к выдаче Свидетельства о допуске к работам, 138.38kb.
• Трии, служит тезис о принципиальной допустимости, приемлемости, а порой даже благотворности,, 411.15kb.
• Курсовая работа тема: «Алкалоиды и история их открытия», 101.03kb.
• Некоторые нерешенные вопросы в исследовании сенсорной системы у человека и ее обусловленности, 144.69kb.
• Тверской Государственный Университет Химико-Биолого-Географический факультет Кафедра, 103.37kb.
• Травы Гекаты в роли целителей, 2705.54kb.
• Дозы излучения и единицы измерения, 180.6kb.
• Болезнь, характеризующаяся непреодолимым влечением к наркотикам (напр., морфину), вызывающим, 19.62kb.

3. МНОГОСТУПЕНЧАТЫЙ ПРОЦЕСС КАНЦЕРОГЕНЕЗА И МОДЕЛИ РАДИАЦИОННОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА

За последние десять лет понимание клеточных и молекулярных процессов, которые в конечном счете ведут к различным типам рака, увеличилось подобно взрыву. Появились некоторые простые принципы, которые уже включаются в модели радиационного канцерогенеза. Однако большое количество комплексных и модифицируемых факторов еще не оценено количественно, в связи с чем прогностическая ценность моделей очень ограничена. Это относится, в особенности, к экстраполяциям без фактических данных, которые, в то же время, являются конечной целью создания таких моделей; в частности, оценки риска после воздействия низких доз, накопленных за длительные периоды времени. Необходимо признать, что механистические модели радиационного канцерогенеза, по существу, используют вероятность перехода клетки или ткани от одной стадии канцерогенного процесса к следующей.

Все же, согласно [11], где рассмотрены канцерогенные риски от химических агентов, «единственный аргумент, поддерживающий беспороговую гипотезу, основан на предположении, что все процессы, которые действуют как барьеры при атаках мутагенов, являются вероятностными (probabilistic) барьерами, и что вероятностное распределение является бесконечным (and that the probability distribution is infinite).

Более возможно, однако, что оно является конечным. Это предположение о вероятностях неизбежно имеет следствием то, что порог с нулевым риском исключен априори. Другими словами, заключение об отсутствии порога не является результатом научного анализа, но предположением априори, присущем всем моделям, используемым в канцерогенезе и в радиационном канцерогенезе в частности¹⁹.

Общепризнано, что процесс канцерогенеза проходит ряд стадий, причем клетки с неограниченным пролиферативным потенциалом (стволовые клетки), приобретают некоторые наследственные изменения, то есть соматические мутации, ведущие от плохого к еще более худшему. Ни одна из индивидуальных стадий по отдельности не ведет к раку. Рак, скорее всего, является результатом накопления всех необходимых изменений в одной стволовой клетке, которая выживает, несмотря на накопленные повреждения. Число этих стадий может варьировать в зависимости от типов рака (от двух до шести), но является последовательностью. Указанные количества стадий, отражающие изменения в предполагаемых онкогенах или генах-супрессорах опухоли, ведущие к трансформации нормальной клетки человека в злокачественную, почти исключительно были получены из обсчета кривых «Частота — возраст» для различных злокачественных новообразований [12].

Для некоторых типов опухолей, таких, как ретинобластома или рак прямой кишки, молекулярно-патологические исследования продемонстрировали, что число генетических изменений, обнаруженных в клетках опухоли, было в хорошем соответствии с теоретически вычисленными значениями.

Наиболее изученный рак в отношении прогрессии злокачественного процесса от нормальной стволовой клетки до агрессивного рака — рак толстой (colon) кишки [13, 14]. Идентифицирована последовательность мутаций в определенных генах, которые ведут к развитию неоплазмы, через ряд морфологически отличных стадий, приводя к агрессивному раку толстой кишки. Для некоторых типов рака толстой кишки первой стадией развития является наследуемая мутация в одной из аллелей гена APC, что делает все клетки эпителия толстой кишки более восприимчивыми к росту доброкачественной (benign) аденомы за счет второй копии гена APC (as the second copy of the APC gene), а супрессор опухоли MCC (для «мутаций при раке толстой кишки») теряется, обычно цельным геном. Это ведет к развитию аденомы как первой стадии роста опухоли.

Гены типа APC, управляющие и регулирующие пролиферацию в нормальном эпителии кишки, называются генами-супрессорами опухоли. Если обе копии такого гена повреждены (наиболее часто один ген или поврежден или не работает, например при гиперметилировании, а другой — потерян, что называется «потерей гетерозиготности»), то пролиферация выходит из-под контроля, хотя ситуация все еще далека от состояния малигнизации. Однако в процессе этого прогрессивного аденоматоза состояние клеток становится все более и более нестабильным и способно привести к накоплению следующих мутаций генов, которые в норме имеют регуляторные функции, типа c-Ki-ras. Такие гены могут стать постоянно активированными и превратиться в онкогены. Сходная ситуация наблюдается и для других генов-супрессоров опухоли, типа DCC. Ген белка р53²⁰ может быть потерян до этого; клон развивается через мутации и селекцию, ускользает от механизмов контроля организма и растет автономным способом, инфильтруя соседние ткани и органы и образуя метастазы.

Эти пять отдельных стадий, идентифицированных при неопластическом развитии опухолей толстой кишки, которые (стадии) являются мутационными событиями [15], находятся в хорошем соответствии со значением от 4 до 7 генетических изменений, предсказанных из теории [12]. Только недавно экспериментально продемонстрировано, что изменения в трех определенных молекулярных механизмах (активности теломеразы, регулировании клеточного деления и обхода апоптоза) не только необходимы, но и достаточны для изменения фибробластов человека и клеток эпителия от нормального фенотипа к полностью злокачественному [16]. Для радиобиологии является критическим вопросом, какая из различных стадий может быть индуцирована радиацией.

Эмпирические / механистические модели многоступенчатого канцерогенеза, которые используются для исследования эффектов радиации, базируются на данных о многоступенчатом канцерогенезе при раке толстой кишки. Главные движущие силы инициирования и прогрессии — это мутации, которые ведут стволовую клетку от одной стадии к другой. Однако в более современные модели [17] включены комплексные взаимодействия с клональной экспансией, программированной клеточной гибелью и дифференцировкой, все из которых имеют решающее значение в прогрессии злокачественного новообразования. В математических моделях эти процессы представлены только векторами и вероятностями. Чтобы понимать, что же действительно происходит, мы должны исследовать каждый из этих биологических процессов в деталях и изучить то, как он может затрагивать малигнизационную прогрессию исходной стволовой клетки.


4. ОНКОГЕНЫ И ГЕНЫ-СУПРЕССОРЫ ОПУХОЛЕЙ

Ряд генов, которые при мутациях ведут к прогрессии канцерогенного процесса на дальнейшую стадию, были недавно охарактеризованы с точки зрения их нормальных функций и в аспекте изменения последних, происходящих в результате мутации. Исследования в этой области очень актуальны. Продукты указанных генов принимают участие в разнообразных метаболических путях нормальной клетки, хотя более всего они участвуют в регуляции клеточной прогрессии и пролиферации (хотя функции гена, даже не связанные с пролиферацией, также часто ассоциированы с генами, участвующими в канцерогенном процессе, как это происходит, например, в случае генов, кодирующих белки репарации ДНК — типа BRCA1 [18] или BRCA2 [19]). Используется два различных типа мутаций для классификации подобных генов: те гены, которые мутация активирует (они называются протоонкогенами перед мутацией и онкогенами после мутации), и те гены, мутации которых ведут к потере функции (они называются генами-супрессорами опухолей).

При развитии рака кишки потеря функции APC гена-супрессора опухоли — первая стадия. Потеря функции генов-супрессоров — первая стадия у большинства солидных раков, в то время как при развитии лейкоза и лимфомы первая стадия — активация протоонкогена в онкоген, то есть, транслокация промотора из активного центра, где обычно подобный промоторный сайт гена (promoting gene site) подавлен [20]. Показано, что при развитии лейкоза и лимфомы человека возле многих генов на молекулярном уровне обнаружены специфические хромосомные транслокации [10]. Специфические транслокации играют также ключевую роль в генезе радиационно-индуцированного рака щитовидной железы у детей.

Рак щитовидной железы у детей очень редок. Значительное повышение частоты этого новообразования у детей на Украине и в Белоруссии после Чернобыля означает, что каждый такой рак индуцируется радиацией с вероятностью более 90% [21]. Это впервые дает уникальную возможность искать мутации типа «отпечатков пальцев» в опухолях, которые (мутации) имели бы специфичную радиогенную природу. Пока имеется достаточно слабое свидетельство о существовании подобных мутаций. Правда, была найдена определенная активация транслокации в ret онкогене [22, 23].

PTC онкогены, характерные для папиллярного рака щитовидной железы, обнаруживаются в радиационно-индуцированных раковых образованиях этого органа более часто, чем при спонтанных раках щитовидной железы, возникающих в более позднем зрелом возрасте. Транслокация PTC3 характерна для рано возникающего рака щитовидной железы у маленьких детей с очень агрессивным ростом опухоли; транслокация PTC1 характеризует менее агрессивный рак щитовидной железы у детей более старшего возраста с более длинным латентным периодом [23]. Первоначальное предположение, что эти ret перестановки могут быть «отпечатками пальцев» лучевого происхождения является, по-видимому, неверным.

Наиболее интересный аспект — это специфика молекулярного механизма, который ведет к активации транслокации ret протоонкогена. Так как считается, что указанный процесс — ранняя, если не первая стадия канцерогенной прогрессии индуцированных радиацией раковых образований, то исследование молекулярных механизмов инициирующего эффекта радиации в клетках-мишенях сконцентрировано на этом высокоспецифичном событии.

Транслокации — типичные эффекты радиации на хромосомы и они, по-видимому, связаны с ДР ДНК. Поэтому транслокации, которые ставят протоонкоген под влияние другого, адекватно активного гена, ни в коей мере не случайны — они должны возникнуть как шанс, также, как другие транслокации и перестановки происходят после облучения во всем геноме. Таким образом, когда соединяющиеся области двух транслоцированных и слитых генов образуют последовательность, невероятная степень специфичности становится очевидной [23]: эта специфичность настолько высока, что она несовместима с любой степенью хаотичности, которая расценивается как признак молекулярных радиационных эффектов.

Средняя доза на щитовидную железу индуцированных радиацией тиреоидных раков составляет менее 20 сГр [21]. Эта доза дает менее 10 ДР ДНК на клетку {6}. Если предположить, что щитовидная железа очень маленьких детей содержит приблизительно 10.000 стволовых клеток, то доза в 20 сГр должна индуцировать около 100.000 ДР на цельный орган. Риск индуцированного радиацией рака щитовидной железы в Белоруссии составляет около 0,1%. Это означает, что приблизительно 108 ДР приводят к одному раку щитовидной железы. Даже не возникает вопроса, что при этом относительно малом числе ДР имеется высокая вероятность наличия двух ДР в двух критических генах, которые принимают участие в ret-PTC транслокациях. Действительно, общее количество человеческих генов составляет 10⁴ (десять в четвертой степени). Число пар оснований в геноме — более 10⁹ (десять в девятой степени) {7}. Поэтому шанс поразить две специфические комбинации пар оснований с формированием ДР составляет 10^–18 (десять в минус восемнадцатой степени) и, таким образом, подобное событие совершенно невероятно.

Очевидно, что указанные транслокации не могут быть результатом случайных разрывов и воссоединений в ret протоонкогене и в другом функционирующем гене, даже если мы примем за аксиому огромный уровень естественной селекции активного онкогена.

Таким образом, несмотря на тот факт, что радиация, как известно, индуцирует транслокации, механизмы, ведущие к активации транслокаций протоонкогена, являются значительно более комплексными, чем случайное образование и воссоединение ДР ДНК²¹.

Более вероятно участие таких процессов репарации, как гомологичная рекомбинация. Если любой из участвующих генов типа ELE действительно демонстрирует подходящую гомологию с частями ret протоонкогена, индивидуальный или комплексный ДР²² в любом из этих двух генов, в принципе, был бы совместим с наблюдаемой высокой степенью молекулярной специфичности соединяющихся областей при транслокации.

Мутации, связанные с потерей функций генов-супрессоров опухоли, однако, более легко увязываются с природой прямых и косвенных лучевых эффектов на ДНК и хромосомы. Принимая во внимание, что активация онкогена очень специфична, мутации гена-супрессора могут происходить из-за случайных делеций больших количеств ДНК, больших частей гена, полного гена, или даже более чем одного гена. Если другая аллель несет мутацию (типа точковой мутации или ингибирования гена метилированием), являющуюся совместимой с выживанием и неограниченной пролиферацией стволовых клеток, то такая потеря может допускаться клеткой. Для многих солидных опухолей инактивация гена-супресора, как полагают, является первой стадией канцерогенного процесса и обычно затрагивает тканеспецифичный ген «контроллер» (gate keeper), который, после потери функции, дает возможность прохождению последующей клональной экспансии ткани специфическими стволовыми клетками [24].

Это клональное расширение (экспансия) может быть связано со спонтанной или индуцированной нестабильностью генома, которая увеличивает возможность накопления мутаций, необходимых для малигнизации. Данная первая потеря функции после мутации гена «контролера» является, вероятно, мутацией, лимитирующей скорость [или частоту — rate]. Так как гетерозиготные мутации — характерное следствие ДР ДНК, то исследование радиационного канцерогенеза сфокусировали на этом типе мутаций и, таким образом, на роли и судьбе ДР ДНК.


5. ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕПАРАЦИИ ДНК

Даже единственный трек от редкоионизирующей радиации имеет конечную вероятность создания одного или даже более чем одного ДР в ядре [25]. Поэтому клеточные последствия ДР, такие, как потеря гетерозиготности, являющаяся основным механизмом инактивации гена-супрессора опухоли, возможны, в принципе, при самых низких дозах и мощностях доз.

Хотя ДР индуцируются даже очень малыми дозами, они могут быть восстановлены очень эффективно одним из двух различных механизмов репарации. Оба механизма ведут к воссоединению двунитевой ДНК, но один механизм использует доступную генетическую информацию с помощью процесса гомологичной рекомбинации, которая может иметь итогом правильное воссоединение разрыва [26]. Высокая точность репарации при этом процессе обусловлена ренатурацией поврежденного конца ДНК на его копии, лежащей на гомологичной хромосоме (перед S-фазой) или, альтернативно, на его сестринской хроматиде.

Эта совершенная гомологичная ренатурация²³ происходит в течение мейоза. Однако ренатурация для гомологичной рекомбинационной репарации требует гомологии только по ограниченной длине последовательности оснований, хотя имеется мало данных о количестве и степени требуемого соответствия. Указанный процесс может происходить также между неродственными генами, которые имеют только частичную гомологию. Механизм гомологичной рекомбинационной репарации выглядит как механизм, который преобразовывает ДР ДНК в точковые мутации или в специфические транслокации. МКРЗ в [10] заключает, что радиационный мутагенез преимущественно может происходить через делеции ДНК после ошибочной репарации и через неточную рекомбинацию ДР ДНК.

Более обычным является, по крайней мере при высоких дозах или при высоких повреждающих концентрациях ДНК-тропных агентов, лигазный механизм концевого соединения. Комплекс молекул репарации, состоящий из ДНК зависимой фосфокиназы и двух других белков, названных Ku70 и Ku80, присоединяется к свободным концам поврежденной ДНК и облегчает ее воссоединение, но без коррекции правильности последовательности ДНК относительно неповрежденной копии. Хотя этот механизм воссоздает основную структуру нити ДНК и, таким образом, позволяет клетке проходить через митоз, часты случаи ошибочной репарации, которая заключается в замене пар оснований²⁴, в мутациям «со сдвигом рамки считывания»²⁵ или, в большинстве случаев, в делециях разного размера [27]. Наиболее комплексные повреждения ДНК более вероятно имеют ошибочно репарированные участки [28]. Было клонировано и/или картировано (mapped) 13 человеческих генов, участвующих в репарации лучевого повреждения ДНК; из них по крайней мере 5 генов участвуют в репарации ДР [10].

Типы повреждений ДНК перед репарацией, которые можно объяснить, используя микродозиметрические модели, значительно отличаются от типов повреждений ДНК после репарации. Существует гипотеза, что точность репарации (которая может быть связана с относительной частотой репарации путем гомологичной рекомбинации), увеличивается, если концентрация первичных повреждений (то есть, частота простых и сложных модификаций структуры ДНК) уменьшается. Однако определение зависимости точности репарации от количества первоначально индуцированных разрывов требует очень сложных и трудоемких экспериментов, которые и не были проведены. Главная проблема в том, что для анализа репарации ДНК необходимы высокие дозы излучения, в частности, при определении репарации на уровне генов. Если бы можно было показать, что точность репарации ДР зависит от концентрации повреждений ДНК, то это было бы сильным аргументом против простой пропорциональности между дозой и повреждениями ДНК, инициирующими рак.

6. РОЛЬ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА

Другой механизм, который связан с изменениями в типе повреждений ДНК — радиационно-индуцированная нестабильность генома. До недавнего времени полагали, что облученные клетки представлены одной из двух стадий: либо клетка не была повреждена, и все ее потомство будет неповрежденным, либо она была повреждена, и все ее потомство унаследует это повреждение.

Продемонстрировано, однако, что большинство явно «неповрежденных» клеток приобретает состояние нестабильности генома в результате которого увеличена вероятность нового, но спонтанного повреждения генома в каждом пострадиационном поколении для многих генераций клеток. Феномен обнаружен и in vitro и in vivo, причем имеются доказательства, что указанное явление играет важную роль в радиационном канцерогенезе [29, 30].

Значение этого механизма составляет предмет обсуждения. Некоторые типы отсроченных эффектов, типа хромосомных перестроек [31], генных мутаций [32] или амплификации генов, могут привести к трансформации выжившей клетки после нескольких делений.

Мутационное повреждение, происходящее вследствие индуцированной радиацией нестабильности генома, фундаментально отличается от непосредственно индуцированной облучением мутации. Большинство мутаций, вызванных радиацией непосредственно, включают потерю больших участков тестируемого гена, ведя к легко обнаруживаемой утрате гетерозиготности. В то же время, большинство мутаций, обусловленных радиогенной нестабильностью генома, включают точковые мутации и небольшие делеции [32]. Мы заключаем, что индуцированная радиацией нестабильность генома не ведет к мутациям, которые специфичны для облучения, но увеличивает частоту тех мутаций, которые происходят спонтанно (вероятно, по сходным механизмам). Это заключение основано на анализе спектра мутаций в потомстве облученных клеток in vitro и поддержано также исследованиями молекулярного спектра мутаций в индуцированных радиацией раковых образованиях in vivo.

На опухолях мышей были выполнены эксперименты с целью проверки гипотезы, согласно которой индуцированные радиацией опухоли должны демонстрировать потерю больших частей ключевых генов-супрессоров, в отличие от индуцированных вирусом или «спонтанных» опухолей, в которых ожидаются точковые мутации. В исследовании, посвященном сравнению индуцированных -излучением костных опухолей со спонтанными остеосаркомами или с саркомами ретровирусной этиологии, значительные делеции в гене p53 были найдены только в опухолях радиационного происхождения, в то время как спонтанные или вызванные вирусом опухоли несли исключительно точковые мутации (М. Atkinson, персональное сообщение). Однако большие делеции в p53 были обнаружены не более чем в 30% радиогенных случаев, делая возможным участие необнаруженных точковых мутаций в генезисе опухолей кости после воздействия -излучения.

Это представление подкрепляется недавними результатами на 20-ти опухолях печени, которые были диагностированы в когорте людей, контактирующих с торотрастом. В 95% случаев продемонстрировано наличие точковых мутаций в p53 [33]. Авторы заключают, что генетические изменения, ведущие к раку печени, являются скорее результатом индуцированной нестабильности генома, а не прямого эффекта лучевого воздействия {8}. Хотя роль индуцированной радиацией нестабильности генома в развитии неоплазм еще должна быть установлена [10], мы предполагаем, что:

• Прямая индукция потери гетерозиготности как следствие индуцированных радиацией комплексных ДР может играть меньшую роль в радиационном канцерогенезе, чем малые мутации, которые также происходят спонтанно и которые могут только стать более частыми в результате индуцированной радиацией нестабильности генома.
  
• Если это заключение правильно, то любой механизм, который участвует в процессинге спонтанного или «физиологического» повреждения ДНК, должен также модулировать степень и частоту повреждений ДНК, которые происходят в результате индуцированной радиацией нестабильности генома. Так как клетка способна восстановить очень высокий уровень эндогенных повреждений ДНК без значительных мутационных последствий, дальнейшее небольшое приращение таких повреждений ДНК от низкоуровневого облучения или от облучения в малой дозе должно быть репарировано равноэффективно. Частота мутаций увеличится только тогда, когда будет происходить воздействие в более высокой дозе и при большей мощности дозы. В этом случае способность к точной репарации повреждений ДНК может стать недостаточной.
  
• Механизм, индуцирующий радиационную нестабильность генома, по-видимому, включает неядерную мишень [34] и регулируется окислительным стрессом [35], который также является главной причиной формирования метаболических повреждений ДНК. Эти экспериментальные наблюдения несовместимы с механизмом одиночного попадания, который является основанием для микродозиметрического оправдания ЛБК.
  
• Мы заключаем, что если радиационная нестабильность генома — действительно ключевой механизм радиационного канцерогенеза, то нелинейная, или пороговая закономерность кривой «Доза — эффект» будет более вероятной для дозовой зависимости радиационно-индуцированного рака, даже если радиационная нестабильность генома сама индуцируется в соответствии с линейной зависимостью «Доза — эффект».