Биологические и эпидемиологические эффекты облучения в малых дозах

Вид материала

Содержание

Morio Yonezawa
Research Institute for Advanced Science and. Technology, Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka 599-8570
2. Материалы и методы
2.3. Определение числа клеток в крови
2.4. Определение тенденции к геморрагиям
2.5. Приготовление образцов органов для определения р53
2.6. Вестерн-блот-анализ с моноклональными антителами к р53 и определение р53
3.2. Адаптирующее облучение снижает геморрагические тенденции после повреждающего воздействия в дозе 6,5 Гр
3.3. Адаптирующее облучение снижает содержание р53 ниже уровня у интактных животных в селезенке мышей через 5 ч после повреждающ

Подобный материал:

1 ... 21 22 23 24 25 26 27 28 ... 42

РЕЗЮМЕ

На индивидуальных препаратах лимфоцитов человека исследован эффект малых доз в диапазоне от 0,01 до 2 Гр. В качестве показателя радиопоражаемости выбран параметр частоты микроядер в культуре лимфоцитов в условиях цитокинового блока.

Тип вероятностного распределения радиационно-индуцированных повреждений статистически описывался как ассиметричный в случае воздействия на образцы крови Х-излучения в очень низких дозах (0,01–0,1 Гр). Сходная картина отмечена и для необлученной контрольной популяции. Однако при 1 Гр и выше кривая нормального распределения частоты может быть описана с помощью аппроксимации ассиметричным рассеянием (appr. symmetrical scatter) для полученных приращений.

Основные параметры линейной регрессии для кривой зависимости приращения частоты микроядер от поглощенной дозы, такие как наклон (который хорошо корреллировал с рассматриваемыми переменными и с пропорцией переменных, рассчитанных для Х (то есть, R²), анализировались при изучении зависимостей «Доза — эффект» во всем диапазоне — от 0,01 до 2 Гр. Несмотря на значительные изменения, полученные в интервалах, примыкающих к самой малой дозе 0,01 Гр, ниже «порога» около 0,2 Гр не обнаружено зависимости между поглощенной дозой и исследуемым параметром^¹⁰⁶.

Отмечены некоторые изменения частоты выхода радиационно-индуцируемых микроядер после повышения уровня экзогенных антиоксидантов in vitro с помощью водорастворимой формы -токоферола.

Сходным образом, увеличение таких антиоксидантов, как витамины Е и С в сыворотке людей, приводило к повышению радиорезистентности лимфоцитов этих индивидуумов при тестировании in vitro.

Ответ к очень малым дозам может быть охарактеризован как специфический ответ, индуцируемый немногими попаданиями. В то же время, в этом дозовом диапазоне биологическая защита, аналогичная увеличению антиоксидантной способности и активации репарации в клетках, может помочь организму существенно снизить радиочувствительность.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kormos, Cs., Koteles, G.J. (1988), Micronuclei in X-irradiated human lymphocytes. Mutat. Res. 199, 31-35.

2. Koteles, G.J. (1996), The human lymphocyte micronucleus assay. A review on its applicabilities in occupational and environmental medicine. Centr. Europ. J. Occup. Environm. Med. 2, 12-30.

3. Koteles, G.J., Bojtor, I. (1995), Radiation-induced micronucleus frequency alterations in lymphocytes from individuals of an urban population. Centr. Europ. J. Occup. Environm. Med. 1, 187-198.

4. Bognar, G., Otos, M., Koteles, G.J. (1997), Detection and measurement of antioxidant capacity in human sera. Centr. Europ. J. Occup. Environm. Med. 3, 293-297.

Радиоадаптивный ответ у мышей С₅₇BL/6: подавление аккумуляции р53 после воздействия Х-излучения в малой, адаптирующей дозе {59}

Morio Yonezawa*, Takeo Ohnishi**, Ken Ohnishi**, Jim Misonoh***

* Исследовательский институт прогресса науки и технологии, Осака, Япония

** Медицинский университет, Нара, Япония

*** Центральный исследовательский институт индустриальной электроэнергии, Чиба, Япония

Yonezawa M., Ohnishi T., Ohnishi K., Misonoh J. Radio-adaptive survival response in mice — suppression of p53 accumulation after x-irradiation by small dose pre-irradiation in С57BL/6 mice. In: “The Effects of Low and Very Low Doses of Ionizing Radiation on Human Health”, ed. by WONUC. 2000. Elsevier Science B.V. P. 351–356.

Morio Yonezawa*, Takeo Ohnishi**, Ken Ohnishi**, Jim Misonoh***

* Research Institute for Advanced Science and. Technology, Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka 599-8570

** Nara Medical University, Kashihara, Nara 634-0000

*** Central Research Institute of Electric Power Industry, Abiko, Chiba 270-1166, Japan

РЕЗЮМЕ

Исследование направлено на объяснение биологических и молекулярных механизмов радиоадаптивного ответа по тесту выживаемости, индуцированного путем адаптирующего воздействия Х-излучения в дозах 30–50 сГр за две недели до среднелетального воздействия радиации на мышей C₅₇BL/6.

Обнаружено, что в условиях предварительной радиационной адаптации (45 сГр) интенсифицируется восстановление числа эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов после [повреждающего] сублетального облучения. Количественное определение содержания гемоглобина в фекалиях продемонстрировало, что предварительное облучение значительно снижает геморрагические тенденции после сублетального воздействия. Результат совпадает с наблюдениями, опубликованными другими исследователями и нами, согласно которым радиационно-индуцированная гемопоэтическая гибель у мышей тесно связана с тромбоцитопенией и приводит к церебро-медуллярным геморрагиям в продолговатом мозгу (oblongata).

Для исследования молекулярных механизмов индуцированной радиорезистентности методом Вестерн-блоттинга определяли ключевой белок р53, который медиирует сигнал трансдукции, приводящий либо к блоку в G₁ фазе (что способствует репарации повреждений ДНК и выживаемости клетки), либо к апоптозу (клеточной гибели). Аккумуляция р53 в селезенке через 5 ч после воздействия Х-излучения в дозе 3 Гр в значительной степени подавлялась предварительным облучением в дозе 45 сГр. Само по себе адаптирующее облучение не изменяло уровень р53 через 2 недели после воздействия. Мы предполагаем, что апоптотическая гибель радиочувствительных клеток после предварительного воздействия стимулирует пролиферацию здоровых, радиорезистентных, замещающих клеток. Подавление экспрессии р53 путем адаптирующего облучения может иметь результатом снижение апоптоза через сигнал трансдукции после воздействия в разрешающей (повреждающей) дозе 3 Гр. Таким образом, в результате остается большее количество жизнеспособных гемопоэтических клеток. Это может облегчать восстановление гемопоэтической ткани после острого облучения, приводя к снижению геморрагий и к уменьшению гибели клеток костного мозга.

1. ВВЕДЕНИЕ

Радиоадаптивный ответ в клеточных системах впервые описан в 1984 г. [1] для лимфоцитов человека, инкубированных с [³H]- тимидином, и в 1987 г. [2] для клеток китайского хомячка (СНО) после воздействия Х-излучения. В 1988 г. Feinendegen et al. [3] описали радиоадаптивный ответ по тесту активности тимидинкиназы для клеток костного мозга мышей, облученных in vivo.

Как показано нами ранее [4, 5], предварительное воздействие Х-излучения на мышей ICR индуцирует два типа радиорезистентности (по критерию снижения гибели клеток костного мозга), которые зависят от адаптирующей дозы: через 2 недели после облучения в дозах 30–50 сГр и через 2 месяца после воздействия в дозах 5–10 сГр.

Сформировавшаяся радиорезистентность не была обусловлена предварительным облучением только головы и индуцировалась через адаптивный ответ в кроветворных тканях. Однако последний требовал облучения целого тела (и головы, и туловища), и, поэтому, показана связь между индукцией адаптивного ответа и облучением костного мозга и кроветворных тканей [5]. Для мышей C₅₇BL/6 также были обнаружены два типа адаптивного ответа [6]. Эти результаты противоречат предыдущим наблюдениям, что биологический эффект ионизирующей радиации, при котором повышается опасность лучевых повреждений, увеличивается в зависимости от повышения суммарной дозы {60}.

В представленной работе мы исследовали формирование приобретенной радиорезистентности (адаптирующее облучение в дозах 30–50 сГр; интервал между воздействиями 2 недели), для выяснения механизма указанного феномена. Схема опыта выбрана из соображений, согласно которым механизм этого типа радиорезистентности кажется более простым.

Для определения причинной связи с пострадиационной гибелью клеток костного мозга проводили подсчет числа клеток в периферической крови, а также регистрировали наличие крови в фекалиях [7, 9]. Поскольку известна важная роль ключевого белка р53 в конечном звене пути передачи сигнала, определялась аккумуляция этого белка в различных тканях [10]. Исследованы два главных аспекта функционирования белка р53, модифицирующие выживаемость и пролиферацию облученных клеток: первый связан с временным блоком в фазе G₁, а другой — с апоптозом.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Животные

Использованы неинфицированные патогенными микробами (в особенности, Pseudomonas aeruginosa) 4-х-недельные мыши-самцы линии C₅₇BL/6N. Животные содержались в чистой окружающей среде, по десять в клетке, при относительной влажности 241 и 6010% <...>. Воду давали ad libitum. Для предотвращения загрязнения бактериями воду подкисляли HCl. <…>.

2.2. Облучение

Адаптирующее воздействие Х-излучения на мышей возрастом 6 недель проводили при дозе 45 сГр (45 сГр/мин). Параметры контролировали дозиметрически. Для всех опытов осуществляли контроли с ложным облучением. Через две недели после предварительного воздействия мышей облучали в сублетальной дозе Х-лучами.

Кровь собирали на 15-й день после адаптирующего воздействия.

2.3. Определение числа клеток в крови

Эритроциты, лейкоциты и тромбоциты просчитывали на автоматическом счетчике. <…>. Число клеток для необлученных мышей составило: 152,61,8; 83,06,4 и 1043,24,1 для тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов соответственно.

2.4. Определение тенденции к геморрагиям

Осуществляли по методу, основанному на регистрации скрытого гемоглобина крови в фекалиях [4] в модификации Yonezawa et al. [6]. <…>

2.5. Приготовление образцов органов для определения р53

Через 5 ч после второго облучения (3 Гр), животных забивали. Выделяли мозг, тимус, правое легкое, селезенку, часть печени и нижнюю половину тонкого кишечника. Клетки костного мозга выделяли из правого и левого бедра (femora). <…>. Клетки и ткани разрушали замораживанием-оттаиванием в жидком азоте, затем добавляли детергенты NP-40, дезоксихалат и Ds-Na до конечных концентраций 1%, 1% и 0,05% соответственно. Центрифугировали при 18.500 g. Отбирали надосадочную жидкость и определяли в ней концентрацию белка.

2.6. Вестерн-блот-анализ с моноклональными антителами к р53 и определение р53

<…>. Для подтверждения позиции полосы р53 в качестве негативного контроля использовались дефицитные по р53 эмбриональные клетки фибробластов мышей — MT158-8.<…>

На рисунках^¹⁰⁷, иллюстрирующих определение количества р53 для каждого органа, приведены средние величины для 2–3 мышей на каждую точку. Значения для р53 вместе с SE (стандартное отклонение) представлены как отношения количества двух белков в облученных группах (с адаптирующим и без адаптирующего воздействия) к соответствующему количеству в необлученных группах.

Данные представлены в виде M  m.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Восстановление числа клеток крови после воздействия в сублетальной дозе 5 Гр, модифицируемое адаптирующим облучением

Кровь собирали на 15-й день после воздействия в дозе 5 Гр (время стимуляции восстановления при действии радиопротекторов [11], а также время, когда смертность [опустошение] костного мозга наиболее заметна после облучения в среднелетальных дозах).

Из табл. 1 следует, что восстановление всех трех типов клеток крови в значительной степени повышается адаптирующим воздействием.

3.2. Адаптирующее облучение снижает геморрагические тенденции после повреждающего воздействия в дозе 6,5 Гр <...>^¹⁰⁸

Таблица 1. Восстановление числа клеток крови в условиях адаптирующего облучения в дозе 45 сГр за 2 недели до воздействия в повреждающей дозе 5 Гр.

Клетки	Ложное облучение	Адаптирующее облучение	Значимость
Тромбоциты (х10⁴мм³)	15,31.7	21,22,0	p < 0,05
Лейкоциты (х10²мм³)	3,90,2	6,00.3	p < 0,01
Эритроциты (х10⁴мм³)	532,113,8	638,9 29,1	p < 0,01

3.3. Адаптирующее облучение снижает содержание р53 ниже уровня у интактных животных в селезенке мышей через 5 ч после повреждающего воздействия в дозе 3 Гр

Анализ проводили методом Вестерн-блотта для 6-ти тканей мышей 4-х групп:

0 сГр + 0 Гр (интактные; 1 мышь);

45 сГр + 0 Гр (облученные только в адаптирующей дозе; 3 мыши);

0 сГр + 3 Гр (облученные только в повреждающей дозе; 3 мыши);

45 сГр + 3 Гр (в условиях адаптивного ответа; 3 мыши) {61}.

Из рисунка виден эффект облучения на аккумуляцию р53 в селезенке. Предварительное адаптирующее облучение не изменяло содержания р53. Повреждающая доза в 3 Гр значительно увеличивала (в 1,5 раза) аккумуляцию р53, но в условиях адаптирующего воздействия перед повреждающим отмечено ингибирование подобной аккумуляции, причем до уровня ниже интактного контроля.

Аккумуляция р53 в других тканях (мозгу, тимусе, легком, костном мозге и тонком кишечнике) в условиях предварительного, адаптирующего воздействия значимо не модифицировалось.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные опыты направлены на получение информации о биологических и молекулярных механизмах радиоадаптивного ответа у мышей C₅₇BL/6, который индуцируется через 2 недели после адаптирующего облучения в дозах 30–50 сГр [6].

В предыдущих исследованиях обнаружено, что частичное облучение (туловища) в дозе 50 сГр, как и тотальное облучение всего тела, индуцирует радиорезистентность у мышей ICR [5]. Это указывало, что адаптивный ответ формируется без участия ЦНС, но, вероятно, путем воздействия на кроветворные ткани. Увеличение выживаемости при адаптирующем облучении перед воздействием в среднелетальной дозе может, поэтому, являться результатом стимуляции репарации повреждений гемопоэза.

В представленной работе исследовано число клеток в крови и предотвращение геморрагий в условиях адаптирующего воздействия. При адаптивном ответе отмечено восстановление числа кроветворных клеток.

Скрытая кровь в фекалиях (на 10–12 день после повреждающего облучения) отображает геморрагические тенденции. Метод имеет повышенную чувствительность по сравнению с микроскопией после аутопсии [7]. 10–12 дней после облучения — это срок, когда геморрагии наиболее значимы [9]. Обнаружено, что адаптирующее облучение снижает геморрагические тенденции и показано, что радиационно-индуцированная гемопоэтическая гибель у мышей является следствием церебро-медуллярных геморрагий в продолговатом мозгу (oblongata) и тесно связана с тромбоцитопенией [10].

В исследовании [7] цитируется заключение Mole [12], что геморрагии могут убивать животных только в течение 2-х недель, нарушая функции некоторых жизненно-важных органов или приводя к значительной анемии. Также цитируется заключение Bond et al. [13], что сама по себе анемия не может вносить важный вклад в радиационную гибель мышей.

Исходя из этих сообщений и наших представленных результатов, мы предполагаем, что снижение лучевой гибели мышей может быть вызвано сокращением функциональных повреждений в некоторых важных органах типа церебро-медуллярного отдела продолговатого мозга, как это отмечено Nakamura et al. [7]. Так, наличие геморрагий в мозгу умерших мышей после облучения показано для среднелетальных доз [7, 14].

Для исследования молекулярных механизмов обнаруженного феномена изучена аккумуляция р53 в мозгу, тимусе, легком, селезенке и тонком кишечнике в условиях адаптирующее + повреждающее облучение с помощью Вестерн-блотта. Известно, что р53 медиирует стресс-индуцированный сигнал трансдукции и играет важную роль на конечном этапе передачи сигнала (in signaling checkpoints) [10].

Адаптирующее облучение в дозе 45 сГр само по себе не давало эффекта на аккумуляцию р53 через 2 недели (то есть, на момент воздействия в повреждающей дозе). Хотя Х-излучение в дозе 45 сГр способно индуцировать р53 в тимусе, костном мозге, мозгу, коже и некоторых других тканях через несколько часов после облучения [10], представленные данные демонстрируют, что повышение уровня не распространяется на срок 2 недели.

Облучение в дозе 3 Гр само по себе значительно повышало уровень р53 в селезенке (в 1,5 раза против интактных животных) через 5 ч. Аккумуляция р53 отмечена также и для других тканей (мозг, тимус, легкое, тонкий кишечник и костный мозг; данные не приводятся). Адаптирующее облучение значительно ингибировало аккумуляцию р53 в селезенке после повреждающего воздействия в 3 Гр вплоть до уровня, ниже соответствующего показателя интактных животных.

Доза 3 Гр приводит к апоптозу в облученных тканях, по-видимому, через конечный этап передачи сигнала (signaling checkpoint) с аккумуляцией р53. Кажется вероятным, что апоптоз высокорадиочувствительных клеток после адаптирующего воздействия повышает резистентность суммарной популяции: радиочувствительные клетки замещаются путем деления оставшихся в живых радиорезистентных клеточных единиц. Временнóй интервал в 2 недели может быть необходимым для полного восстановления функциональных клеток.

Указанный механизм радиоадаптивного ответа был постулирован Кондо (Kondo) в 1988 г. [15]. Согласно ему, интерфазная гибель радиочувствительных клеток стимулирует пролиферацию здоровых замещающих клеток, приводя, в конечном итоге, к радиационному гормезису. Вклад генов апоптоза в приобретенную радиорезистентность после адаптирующего воздействия в дозах 30–50 сГр постулировал Волощак (Woloschak). Причина, по которой этот феномен в наших исследованиях ограничен только селезенкой, не ясна. Ныне мы исследуем апоптоз в ряде тканей и скоро представим результаты.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для исследования радиоадаптивного ответа, индуцируемого у мышей через 2 недели после воздействия в дозе 45 сГр, изучены механизмы его у мышей линии C₅₇BL/6.

1. Предварительное адаптирующее облучение значительно стимулирует восстановление эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов после сублетальной дозы радиации.

2. Предварительное адаптирующее облучение значительно снижает геморрагии (тесно связанные с гибелью клеток костного мозга), индуцированные сублетальной дозой радиации.

3. Экспрессия р53, ключевого белка конечного этапа передачи сигнала трансдукции, ведущего к клеточной гибели или к выживанию, проанализирована в различных тканях. Аккумуляция р53 в селезенке через 5 ч после повреждающего воздействия (повышенная в 1,5 раза по сравнению с необлученным контролем после дозы 3 Гр) значительно подавляется путем предварительного адаптирующего облучения.

4. Исходя из полученных данных, мы предлагаем следующий механизм адаптирующего ответа по тесту выживаемости:

Предварительное адаптирующее облучение в дозе 45 сГр ведет к апоптозу (альтруистической гибели клеток) радиочувствительной популяции в селезенке (гемопоэтическом органе).
Это приводит к пролиферации здоровых, радиорезистентных клеток. В результате, относительно радиочувствительные клетки замещаются радиорезистентными в период перед воздействием в повреждающей дозе.
Само по себе повреждающее облучение индуцирует повышение экспрессии р53 для элиминации сильно поврежденных клеток путем апоптоза. Однако для повышения радиорезистентности клеток необходимо снизить апоптоз (и, соответственно, экспрессию р53) в условиях повреждающего облучения.
Это усиливает восстановление гемопоэтических функций селезенки (гематогенез).
Стимуляция восстановления числа клеток крови, в особенности тромбоцитов, имеет результатом подавление геморрагий и, в конечном итоге, приводит к увеличению 30-ти-дневной выживаемости животных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Olivieri, G., Bodycote, J. and Wolff, S. (1984) Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine. Science 223, 594-597.

2. Ikushima, T. (1987) Chromosomal response to ionizing radiation reminiscent of an adaptive response in cultured Chinese hamster cells. Mutation Res., 180, 215-221.

3. Feinendegen, L.E., Bond, V.R, Booz, J., Muehlensiepen, H. (1988) Biochemical and cellular mechanisms of low-dose radiation effects. Int. J. Radiat. Biol., 53, 23-37.

4. Yonezawa, M., A. Takeda and J. Misonoh (1990) Acquired radio-resistance after low dose X- irradiation in mice. J. Radiat. Res., 31, 256-262.

5. Yonezawa, M., J. Misonoh and Y. Hosokawa (1996) Two types of x-ray-induced radio-resistance in mice.– Presence of 4 dose ranges with distinct biological effects. Mutation Res., 358, 237- 243.

6. Misonoh, J., M. Yonezawa (1997) Dose ranges for radioadaptive response in mice – on the view point of acquired radioresistance after low dose irradiation. In Health effects of low dose radiation, Challenges of 21^st century, Proceedings of the conference organized by British Nuclear Energy Society held in Stratford-upon-Avon UK on 11-14 May 1997, pp. 196-200, British Nuclear Energy Society, London.

7. Nakamura, W., T. Kankura, H. Eto (1971) Occult blood appearance in feces and tissue hemorrhage in mice after whole body X-irradiation. Radiat. Res., 48, 169-178.

8. Nakamura, W., T. Furuse, T. Kasuga (1976) Comparative studies on radiation-induced thrombocytopenic death in SPF and CV mice of same strain. The 16^th Int. Cong. of Hematol., p. 352

9. Yonezawa, M., N. Katoh and A. Takeda (1985) Restoration of radiation injury by ginseng. IV. Stimulation of recoveries in CFUs and megakaryocyte counts related to the prevention of occult blood appearance in X-irradiated mice. J. Radiat. Res., 26, 436-442.

10. Wang, X. and Ohnishi, T. (1997) p53-dependent signal transduction induced by stress. J. Radiat. Res., 38, 179-194.

11. Yonezawa, M., Katoh, N. and Takeda, A. (1987) A convenient method for the determination of radioprotective activity in substances administered after ionizing irradiation. Radiat. Biol. Res. Communications, 22, 173-175.

12. Mole, R.H. (1953) Whole body irradiation - radiobiology or medicine? Brit. J. Radiol., 26, 234-241.

13. Bond, V.P., T.M. Fliedner, J.0. Archambeau (1965) Mammalian radiation lethality, a disturbance in cellular kinetics, AIBS Monograph, p.p. 1-340. Academic Press, New York.

14. Yonezawa, M., N. Katoh, A. Takeda (1989) Radiation protection by Shigoka extract on split-dose irradiation in Mice. J. Radiat. Res., 30, 247-254.

15. Kondo, S. (1988) Altruistic cell suicide in relation to radiation hormesis. Int. J. Radiat. Biol., 53, 95-102.

Blog

Биологические и эпидемиологические эффекты облучения в малых дозах

Содержание