Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
).
.2 Структура и функции нейтральных протеаз
Все нейтральные протеазы можно подразделить на внутриклеточные и внеклеточные. К внутриклеточным нейтральным протеазам относится Са2+- зависимая протеаза - кальпаин [3.4.22.17].
В 1964 году Гурофф впервые описал эту протеазу, которая была окончательно выделена как фермент в 1978 году в растворимой фракции мозга. С тех пор активность кальпаина была идентифицирована в различных тканях и обнаружено его участие во многих клеточных процессах.
Кальпаины - это семейство цитозольных цистеиновых протеиназ, чья ферментативная активность зависит от Са2+. Члены этого семейства участвуют в таких процессах как клеточная миграция, цитоскелетное ремоделирование, клеточная дифференциация и апоптоз. Активация кальпаина наблюдается также при таких патологических состояниях как мышечная дистрофия, сердечная и церебральная ишемия, агрегация эритроцитов, нейродегенеративные болезни, катаракта и болезнь Альцгеймера (Khorchid, Ikura, 2002).
В условиях гипоксии кальпаин подвергается гиперактивации, что непосредственно ведет к деструкции цитоскелета нейронов, а в дальнейшем приводит к гибели клеток по механизму некроза или апоптоза (Хансон, 1992).
Потенциальными субстратами кальпаинов являются белки цитоскелета, некоторые мембранно - связанные ферменты, белки ядерного матрикса, протеинкиназа С, рецепторы, фосфатазы, факторы транскрипции. Ограниченный протеолиз определенных белков кальпаинами показывает необходимость этого процесса для мембранного слияния. Активация Са2+ - зависимых нейтральных протеаз при апоптозе предшествует морфологическим изменениям и фрагментации хроматина в тимоцитах, подвергнутых облучению или действию дексометазона. Ингибиторы кальпаина предотвращают фрагментацию ДНК и гибель клеток. Было показано, что Са2+ - зависимая протеаза тимоцитов является обязательным компонентом каскада протеолитических ферментов метилпреднизолон - индуцированного апоптоза. Ингибиторы кальпаинов блокируют апоптоз HIV - индуцированных Т-лимфоцитов и восстанавливают иммунный ответ этих клеток, что предполагает потенциальное использование ингибиторов кальпаинов в терапии HIV инфекций. Действие этой нейтральной протеазы практически необратимо, что, по-видимому является одной из причин опасности длительного повышения уровня Са2+ в цитозоле (Kуцый и др., 1999).
В ответ на увеличение концентрации Са2+ кальпаины могут осуществлять ограниченный протеолиз ферментов, изменяя тем самым активность последних, увеличивать сродство рецепторов к лигандам, изменять пластичность мембран клеток, расщеплять миофибриллярные белки и нейтрофиламенты, вызывать деструкцию цитоскелетных компонентов клеток (Гусев, 1998).
Одной из важнейших функций кальпаинов является изменение биологической активности различных белков путем ограниченного протеолиза. В частности, таким образом, происходит активирование киназы фосфорилазы b и инактивация гликогенсинтетазы в мышце кролика. Следовательно, увеличение Са2+ в цитоплазме мышечных клеток, наблюдаемое при их сокращении, ведет к повышению активности кальпаинов и тем самым содействует расщеплению гликогена в этой ткани. С другой стороны, фосфатаза фосфорилазы превращается в активную форму с более низкой молекулярной массой также с участием этих ферментов (Croall, Demartino, 1991).
Основные функции кальпаинов мозга, очевидно, связаны с ограниченным протеолизом определенных цитоплазматических и мембранных белков, включая белки рецепторы и протеинкиназу С, а также белков цитоскелета клетки, выполняющих важную роль в регуляции внутриклеточного метаболизма, и с реализацией таких функций нейронов, как аксональный транспорт, трансмембранная передача сигнала, долговременная память и др. (Seubert et al., 1988).
Ключевая роль кальпаинов в нервной системе определяется в большей степени тем, что эти пептидгидролазы характеризуются двойной системой контроля их активности; одной, общей для всех протеолитических ферментов и обеспечиваемой специфическими эндогенными ингибиторами и реактивными предшественниками ферментов, и другой - регулируемой концентрацией эндогенного Са2+. Сочетание в первичной структуре Са2+ - зависимой нейтральной протеазы протеолитического и Са2+ - связывающего доменов, по-видимому, дает возможность строго регулировать активность фермента и включать его в обмен в зоне локального повышения концентрации Са2+, определяя тем самым топографию и временной контроль биологического процесса (Азарян, 1989).
Кальпаины изменяют активность и некоторых протеинкиназ. Так одна из протеинкиназ, осуществляющая фосфорилирование белка 6S рибосом, активируется кальпаинами, а действие последних усиливается при образовании комплексов инсулина с рецепторами на плазматических мембранах клеток (Kenyon et al., 2003).
При наличии в нейтрофилах человека микромолярных концентраций Са2+, и кальпаин, и протеинкиназа С ассоциируют с плазматическими мембранами. Это связывание обуславливает активацию протеиназы, которая в свою очередь осуществляет ограниченный протеолиз протеинкиназы с образованием активной ее формы, не нуждающейся в Са2+ и фосфолипиде. Активированная таким образом протеинкиназа диссоциирует с мембраны клеток и действует внутриклеточно на белки. В отсутствие протеиназы кальций содействует связыванию протеинкиназы С, однако превращение ее в независимую от кальция и фосфолипида форму не происходит и фермент остается ассоциированным с мембраной (Chua et al., 2000). Активирование каль?/p>