Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
?аина путем связывания его с мембраной наблюдается и в эритроцитах (Иванов и др., 1999). Имеются данные и об изменениях агрегационных свойств субъединиц цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках легкого новорожденных мышей путем ограниченного протеолиза с участием кальпаина. Следует отметить, образование в тромбоцитах человека Са2+-независимой протеинкиназы (молекулярная масса 50 тыс. дальтон) из более высокомолекулярного, зависимого от этого иона предшественника, также осуществляется при участии кальпаина (Chua et al., 2000).
Кальпаин с помощью ограниченного протеолиза активирует триптофангидроксилазу клеток печени животных, регулирующих биосинтез серотонина, а также катализирует образование из предшественников кининов, участвующих в воспалительных процессах. Из эритроцитов печени была выделена протеиназа, которая расщепляет пируваткиназу, причем последняя дефосфорилируется, и ее сродство к фосфоенолпировиноградной кислоте снижается (Локшина, 1985).
Показано, что действие таких биологически активных факторов, как полипептидные факторы роста, в частности эпидермальный фактор роста, контролируется путем ограниченного протеолиза с помощью кальпаинов. Имеются сообщения, что кальпаины могут принимать участие и в ограниченном протеолизе факторов роста связанных с рецепторами (Сологуб, Пашковская, 1988).
Кальпаины расщепляют различные белки, однако не действуют на низкомолекулярные синтетические субстраты, обычно используемые при определении активностей других протеиназ. Показано, что кальпаины мозга свиньи и обезьяны гидролизуют некоторые нейропептиды и либерины. Из мышцы сердца обезьяны выделен фермент этого типа, обладающий энкефалиназной активностью (Панченко и др., 1999), а из скелетных мышц человека кальпаины, действующие на нейротензин, динорфин, люлиберин, вещество Р и соматостатин. Кальпаины способны расщеплять также казеин, гемоглобин, однако не действуют на альбумин сыворотки крови. Интересно отметить, что фосфорилированные белки более чувствительны к действию этих ферментов, чем неэстерифицированные их формы (Лишманов и др., 1997).
Установлено, что связывание глутаминовой кислоты со специфическими рецепторами плазматических мембран клеток гиппокампа крыс значительно увеличивается в присутствии кальция, и вероятно, также обусловлено действием кальпаина на эти рецепторы. Оно сопровождается расщеплением фодрина - спектринподобного белка, локализованного на внутренней поверхности плазматических мембран нервных клеток, и таким образом регулируется пластичность мембран (Сологуб, Пашковская, 1998).
Наиболее охарактеризованными членами семейства являются m-кальпаин и -кальпаин (соответственно, кальпаин II и I). Микромолярные концентрации Са2+ активируют m-кальпаин, а для активации -кальпаина требуются миллимолярные концентрации Са2+. Обе изоформы фермента являются гетеродимерами, состоят из большой каталитической 70-80 кДа субъединицы и малой, общей для обоих белков, регуляторной 29-30 кДа субъединицы. Большая субъединица содержит 4 домена (dI-dIV), а малая 2 домена (dV dVI) (Darrel et al., 2003).
Домен I действительно не является доменом, и представляет собой единственную ? - спираль, состоящую из 10 аминокислотных остатков, которая заякоривается в полость dVI. Эта спираль очень важна для стабилизации и активации некоторых кальпаинов.
Домен II содержит в себе каталитическую сторону и может быть разделен на 2 субдомена - dIIa и dIIb (Khorchid, Ikura, 2002). Домен содержит остаток Cys в положении 115 (для - кальпаина) или 105 (для m - кальпаина), остаток His в положении 272 или 262, остаток Asn в положении 296 или 286. Эти аминокислотные остатки образуют каталитическую триаду, характерную для цистеиновых протеиназ таких как кальпаин или катепсины B, L и S. Замечено, что активная сторона Cys расположена в dIIa, в то время как His и Asn, которые образовывают остаток каталитической триады - в субдомене IIb. Каждый из субдоменов связывает по одному атому Са2+ в пептидной петле, состоящей из 8 (домен IIa) или 9 (домен IIb) аминокислотных остатков. Гомологичная последовательность домена II среди различных видов высока (85-93%) (Moldоveanu et al., 2002).
Домен III имеет последовательность, не гомологичную другим полипептидным последовательностям. В связывании Са2+- связывающих доменов молекулы кальпаина с каталитическим доменом II, участвует домен III, связывая фосфолипиды и участвуя в электростатическом взаимодействии (Hosfield et al., 2001). Анализ аминокислотной последовательности показал, что этот домен также содержит 2 потенциальные Са2+ - связывающие последовательности EF-руки, одна из некоторых находится между доменами II/III (остатки 329-341 для -кальпаина; остатки 318-338 для m-кальпаина; в домене IIb кристаллографической структуры m-кальпаина), а другая последовательность находится на границе III/IV доменов (остатки 554-565 для -кальпаина; 541-552 для m-кальпаина; в домене IV кристаллографической структуры m-кальпаина). Последовательность на границе II/III доменов не имеет конформацию EF-руки в кристаллографической структуре m-кальпаина крысы и человека и этот регион, возможно, не связывает Са2+ (Strobl et al., 2000). Таким образом, домен III состоит из 8 нитей по типологии схож с С-2 доменом, обнаруженным у различных белков, включая протеинкиназу С и фосфолипазу С, который взаимодействует с Са2+ и фосфолипидами. Кислая петля внутри домена III предположительно играет роль Са2+- способствующей активации кальпаина (Khorchid, Ikura, 2002).
Домены dIV и dVI являются хорошо охарактеризованными Са2+-связывающими доменами, каждый из которых содержит 5 мотивов EF-руки. Пятые моти