Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
ически идентичны. Очень схожими, но не идентичными являются последовательности активирующих пептидов. Но сходность первичных структур выходит за пределы этих триад (Baldwin et al., 1993). Длинные сегменты вокруг аспартатных триад высоко консервативны. Позиции цистеиновых остатков, тирозина 75 и их окружения также консервативны. Тирозин 75 локализован в, так называемом, подвижном участке, чья подвижность частично покрывает активную сторону (Conner, 2002).
Пептидазы, относящиеся к семейству А1, образованы двудольной структурой, и обе доли структурно схожи, что предполагает наличие общего предшественника - димерной молекулы, состоящей из двух идентичных субъединиц, которые генной дубликацией и генным слиянием эволюционировали в мономерную двудольную структуру. Вторичная структура образована большей частью ?-структурой с небольшими сегментами ?-спиралей (Metcalf, Fusek, 1993). Катепсин Д содержит глубокое активное углубление, которое образовано стенами двух долей. На дне этого углубления локализованы 2 активных остатка аспарагиновой кислоты. Активная сторона углубления связывает либо ингибитор, либо субстрат. Катепсин Д также имеет 3 дисульфида, расположенные в очень консервативных местах, а также 1 дисульфид между цистеиновыми остатками 27 и 96.
Особенностью этого фермента, как и всех остальных аспарагиновых пептидаз является превращение новотранслированных белков в зимогены, а затем последовательно в активные ферменты. Эти пептидазы синтезируются как пре-про-ферменты (Conner, Richo, 1992). На первом протеолитическом пострансляционном этапе происходит отщепление сигнальной пре последовательности. Сигнальная последовательность состоит из 20 аминокислотных остатков и удаляется внутри шероховатого эндоплазматического ретикулума. Зимогены, образованные после первого пострансляционного процессинга, направляются к месту их активации, где они полностью превращаются в активные ферменты. Активация включает распад про-последовательности. Активирующий пептид бывает обычно длиной 44 аминокислотных остатка. Активация происходит как внутримолекулярно, так и внемолекулярно. Во время автоактивации, так называемый, псеудокатепсин Д все еще сохраняет С-терминальную часть активного пептида. Полная активация происходит только с участием других лизосомальных ферментов (Fusek, Vetvicka, 2005).
Важной особенностью катепсина Д является его специфическое ингибирование пепстатином А, который является нековалентным, конкурентным и тесно-связывающим ингибитором (Abdel-Mequid, 1993).
Важной особенностью нормального клеточного цикла катепсина Д является его строгая локализация в кислых компартментах лизосом и различных прелизосомальных и эндосомальных везикулах. Существует, как минимум, 2 пути, по которому клетки направляют катепсин Д в эти компартменты. Во-первых, маннозо-6-фосфат на концах олигосахаридов, прикрепленных во время пострансляционной модификации, распознается двумя рецепторами, которые транспортируют прокатепсин Д к лизосомам и другим кислым компартментам (Figura, Hasilik, 1986). Существует 2 рецептора: катион-независимый маннозо-6-фосфат рецептор, чья молекулярная масса близка к 300 кДа и катион-зависимый маннозо-6-фосфат рецептор с молекулярной массой 46 кДа. Оба рецептора связывают лизосомальные ферменты в сети аппарата Гольджи, образуют комплексы и затем переносятся через клатрин-покрытые везикулы к прелизосомальным кислым компартментам. При низком значении рН происходит высвобождение лизосомальных ферментов от рецепторов, которые затем возвращаются к аппарату Гольджи, в то время как лизосомальные ферменты продолжают направляться к лизосомам. Оба рецептора присутствуют также и на поверхности мембраны плазмы (Zhu, Conner, 1994). Катион-независимый маннозо-6-фосфат рецептор способен связывать внеклеточный прокатепсин Д и переносить внутрь клетки. На самом деле функция этого рецептора более сложная. Кроме того, связывая и направляя лизосомальные ферменты, он функционирует также как рецептор для инсулин-подобного фактора роста II (Fusek, Vetvicka, 2005).
Второй путь направления катепсина Д к лизосомам независим от маннозо-6-фосфата и полностью не изучен (Dittmer et al., 1999). Определенная роль этого пути заключается во взаимодействии прокатепсина Д с просапонинами. Эти две молекулы образуют комплексы и движутся к кислым компартментам независимо от маннозо-6-фосфат рецептора. Предположено, что N-терминальная часть псеудокатепсина Д (другими словами С-конец активирующего пептида) может быть включена во взаимодействие между прокатепсином Д и просапонином. Комплексы этих двух молекул обнаружены внеклеточно (Gopalakrishnan et al., 2004).
Прокатепсин Д образуется после первого протеолитического распада, включая удаление сигнального пептида сигнальными пептидазами. Молекула прокатепсина Д имеет молекулярный вес 52 кД. Она состоит из 392 аминокислотных остатков и при нормальных физиологических условиях гликолизируется по двум остаткам аспарагина. Активирующий пептид длиной 44 аминокислотных остатка находится над углублением активной стороны (Koelsch et al., 1994).
Прокатепсин Д транспортируется к лизосомам и в кислой среде подвергается дальнейшему протеолитическому процессингу, где активирующий пептид отщепляется (как автопротеолизом, так и протеолитическим действием других, в основном, цистеиновых лизосомальных пептидаз), образуя катепсин Д, содержащий одну цепь из 348 аминокислотных остатков. При других физиологических условиях единственная цепь катепсина Д преобразуется в двуцепочечную молекулу (у человека за сч