Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
вы этих доменов взаимодействуют между собой, образуя гетеродимер. Каждый мотив EF-руки схож с таковым мотивом в кальмодулине (24-44% идентичности у - кальпаина и 51-54% у m - кальпаина). Кальпаины представляют собой семейство пента-EF-рук, т.е. содержащие 5 мотивов EF-руки и они уникальны не только тем, что содержат определенное количество Са2+ - связывающих мотивов, но также и тем, что первичная последовательность отличается от таковой у кальмодулина.
Домен dV малой субъединицы содержит кластеры остатков Gly на N-конце, которые участвуют в гидрофобной природе белка. Этот домен не виден в рентгеновских лучах, что предполагает то, что этот домен имеет очень гибкую структуру, которая не заякоривается с другими частями молекулы кальпаина (Strobl et al., 2000).
Транслокация кальпаинов к мембране клетки и их ограниченный протеолиз являются результатами активации кальпаина (Cuervo, Dice, 1998).
В 1981 году было открыто, что автолиз происходит в присутствие Са2+ (Suzuki et al., 1981)
Хотя автолиз происходит быстро, он включает несколько последовательных этапов: 1) для большой 80 кДа субъединицы - кальпаина NH2-терминальных 14 аминокислотных остатка удаляются первыми и образуется 78 кДа промежуточный продукт, затем удаляются дополнительно 12 аминокислотных остатка с образованием 76 кДа автолитического фрагмента; 2) для большой 80 кДа субъединицы m-кальпаина NH2-терминальных 9 аминокислотных остатков удаляются первыми, затем еще 9 остатков с образованием 78 кДа автолитического фрагмента; 3) для малой 28 кДа субъединицы NH2-терминальных 26 аминокислотных остатков удаляются с образованием фрагмента 26-27 кДа, от которого дополнительно отделяются 37 остатков (до Gly-64) - образуется фрагмент 22-23 кДа и в последнюю очередь отделяется еще более 28 аминокислотных остатков (до Ala-92) с образованием 18 кДа автолитического фрагмента. Малая субъединица автолизируется гораздо быстрее, чем большая субъединица в - кальпаине, в то время как в m - кальпаине происходит все наоборот (Brown, Crawfold, 1993).
Эндогенным ингибитором кальпаина является кальпастатин, чья молекулярная масса варьирует от 34 до 280-300 кДа. Хотя гомологичная последовательность среди кальпастатинов не так высока, как у кальпаинов, однако >65% аминокислотной последовательности идентична. Эта последовательность уникальна и не гомологична другим полипептидам, включая цистатины, которые ингибируют многие цистеиновые протеазы, но не кальпаины. Кальпастатин содержит 4 повторения, предельно гомологичные (23-36%), домены из 140 аминокислотных остатков каждый, плюс NH2-терминальный домен, называемый доменом L, который варьирует от 68-78 кДа, завися от размера этого домена L. Обнаружено, что все 4 домена - I,II, III и IV могут ингибировать протеолитическую активность и -, и m-кальпаинов. Каждый из доменов состоит из субдоменов: А, В и С. Домен L единственный, который не обладает активностью ингибитора. Способность отдельных доменов ингибировать кальпаин можно расположить следующим образом: домен I>домен IV>домен III>домен II (от более к менее эффективному) (Kawasaki et al., 1989). Эффективное ингибирование кальпаинов кальпастатином требует, чтобы кальпастатин связывался с молекулой кальпаина в трех местах: Са2+- зависимое включение субдомена А кальпастатина с доменом IV в кальпаине, субдомена С кальпастатина с доменом VI в кальпаине и субдомена В с участком около активной стороны кальпаина (домен IIa или IIb или обоими).
Связывание кальпастатина, содержащего субдомены А и В, с кальпаином предотвращает связывание кальпаина с мембранами, предполагая, что связывание кальпаинов с мембранами осуществляется доменами IV и VI, кальмодулин-схожими доменами в молекуле кальпаина, потому что субдомены А и В кальпастатина связывают домены IV и VI, соответственно (Kawasaki et al., 1993).
Присутствие Са2+ делает кальмодулин более гидрофобной молекулой и Са2+ также может увеличивать гидрофобность кальмодулин-схожих доменов кальпаинов.
Таким образом, из-за того, что наиболее эффективное ингибирование кальпаинов с кальпастатином требует участия всех субдоменов кальпастатина - А, В и С, то, возможно, что все три субдомена должны связываться с кальпаином для максимального ингибирования (Kawasaki et al., 1989).
Многообразие эффектов Са2+-зависимых нейтральных протеиназ обеспечивается активацией ряда ключевых ферментов обмена, рецепторов, а также расщеплением разнообразных белков (миофибриллярных, мембранных белков, цитоскелета). Особенности действия и субклеточная локализация этих протеиназ в местах клеточно-матриксных контактов предполагают определенные взаимоотношения кальпаин-кальпастатиновой системы и компонентов внеклеточного матрикса (Строев и др., 1997).
Карбоксипептидаза М (КП М, КФ 3.4.17.2) была обнаружена Skidgel и соавторами в цитоплазматических мембранах периферических тканей и мозга (Skidgel et al., 1984).
Фермент широко распространен в человеческой плаценте, почках, легких (Skidgel et al., 1991), периферических нервах, головном мозге (Nagae et al., 1992), желтом теле, гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов (Yoshioka S. et al., 1998), эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, лейкоцитах (De Saint-Vis et al., 1995), Активность карбоксипептидазы М в нервной ткани на порядок ниже, чем в плаценте, а в периферических нервах выше, чем в головном мозге. В мозге фермент обнаружен в клетках глиии, а также в комплексе с миелином и миелинформирующими клетками (Nagae et al., 1992).
КП М является гликопротеином с Mr 62000 (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1986). Фермент представлен одной полипептидной цепью и связан с плазматической мембраной при помощи остатка гликоз