Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
ацию в термостат при температуре 37С на 60 минут. Затем к инкубату добавляли по 1 мл 0.3 N раствора ТХУ и выдерживали в течение 15 минут. Далее пробы фильтровали. К 0.5 мл фильтрата приливали 0.5 мл 0.0025 М раствора CuSO4, 4 мл 0.5 N раствора NaOH и 1 мл раствора Фолина. Через 20 минут проводится колориметрирование на фотоэлектроколориметре при ?=670 нм.
Контроль: 1 мл ТХУ+ 0.5 мл гомогената. Через 5 минут добавляли 0.5 мл субстрата.
Стандарт: 2 мМ раствор тирозина
Расчет активности фермента производится по формуле:
, где
- активность фермента, мкмоль/гоп - экстинкция опытного раствора
Ек - экстинкция контроля
Ест - экстинкция стандартного раствора
Тинк - время инкубации, мин
Активность нейтральных протеаз выражали в мкмоль образовавшегося тирозина в расчете на 1 г ткани.
.4.3 Определение активности Са2+-зависимой нейтральной протеазы
Общую и Са2+-зависимую активность нейтральных протеаз определяли по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986).
Гомогенаты тканей готовили на 50 мМ Трис- HCl буфере, рН=7.4.
Субстрат: 1 % раствор казеина, приготовленный в 0.1н растворе NaOH, нейтрализовали 0.2н раствором HCl.
Растворы: 1 мМ CaCl2 и 25мМ EGTA также готовили на 50 мМ Трис- HCl буфере, рН=7.4.
. Для определения общей активности нейтральных протеаз инкубационная смесь состояла:
.3 мл 1 % казеина
.5 мл 10% гомогената
.2 мл 1 мМ CaCl2
. Для определения Са2+-независимой активности нейтральных протеаз инкубационная смесь состояла:
.3 мл 1 % казеина
.5 мл 10% гомогената
.2 мл 25мМ EGTA
Пробы инкубировали 1 час при 37С. Далее реакцию останавливали 1 мл 15% ТХУ. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. 1 мл безбелкового центрифугата нейтрализовали 0.15 мл 10% раствора NaOH и в нем определяли количество фолинположительных соединений по методу Лоури. Оптическую плотность исследуемых образцов измеряли при ?=750 нм. Значения активности для Са2+-активируемой нейтральной протеазы типа I представляли собой разность оптических плотностей для общей и Са-независимой активности.
Активность выражали в мкмоль тирозина/100 мг белка за 1 час.
В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали тирозин.
.4.4 Определение активности глицилглицин-дипептидазы
Активность глицилглицин дипептидазы определяли нингидриновым методом Ли и Такахаши с модификациями (Рева и др., 1982) в печени и в больших полушариях головного мозга бодрствовавших зимой и пробуждающихся весной сусликов. Каждую выделенную ткань взвешивали и гомогенизировали в холодном 0.25М растворе сахарозы в соотношении 1:9 (вес: объем) в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. В среду гомогенизации добавляли 0.001М хлористый кобальт. Все операции проводили на холоду.
Инкубационная смесь содержала 0.4 мл 0.005М раствора глицил-глицина в фосфатном буфере рН 7.6 и 0.4 мл гомогената с 0.001М хлористым кобальтом. Инкубацию проб тканей проводили в ультротермостате при 37С и 10С в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 0.4 мл 5% раствора ТХУ. В контрольные пробы ТХУ добавляли перед внесением субстрата.
Пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли прирост глицина нингидриновым методом.
Цветная реакция
В пробирку отбирали 0.4 мл фильтрата, добавляли 1 мл нингидринового реактива, тщательно перемешивали стеклянной палочкой для получения однородной смеси. Далее пробу помещали на 12 минут (точно!) в кипящую баню и после этого охлаждали холодной водой.
Интенсивность окраски измеряли на КФК-2 при 570 нм против контрольных проб.
Активность фермента выражали в мкмоль глицина, освободивщегося при гидролизе глицилглицина за 30 минут инкубации при 37С и 10С (рН 7.6) в расчете на 100 мг ткани и на мг белка.
Приготовление реактивов. 0,05М фосфатный буфер рН 7.6
.2М раствор фосфата калия -5мл
.2М раствор гидроокиси калия -4.24мл
довести водой до 20мл и определить рН -7.6
. 0,5 М цитратный буфер рН -5.5
.5М раствор лимонной кислоты -5.1 мл
.5 М раствор цитрата натрия -14.9мл
. 0,001 М СоСl2 *6Н2О (М.м =238г)
Взвесить 23.8 мг -СоСl2* 6Н2О и добавить в 100 мл 0.25М раствора сахарозы.
. Нингидриновый реактив (готовить непосредственно перед цветной реакцией)
мг нингидрина взвесить на торсионных весах и растворить в 12 мл 0.5М раствора цитратного буфера рН 5.5 при подогревании на водяной бане (400С). Раствор охладить и к нему добавить 24мл глицерина. Реактив тщательно перемешать.
. 0.25М раствор сахарозы. 8.55г сахарозы перенести в колбу на 100мл и растворить в небольшом количестве воды и затем довести до 100мл.
2.4.5 Определение белка по методу Лоури
Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи (Lowry et al., 1951).
.4 мл исследуемого раствора смешивали с 2 мл раствора С, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляли 0,2 мл реактива Фолина - Чокальтеу. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и через 30 минут колориметрировали при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мм. Предварительно строили калибровочный график по стандартному раствору альбумина и по нему определяли содержание белка в опытной пробе.
.4.6 Исследование температурной зависимости активности
нейтральных протеаз
Для изучения температурной зависимости активности нейтральных протеаз пробы инкубировали при 10, 20, 30, 37 и 40С. Время инкубации во всех случаях составляло 60 мин. Полученные резул