Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии
Диссертация - Биология
Другие диссертации по предмету Биология
?урному уровню (384) (Storey, 1997).
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
.1 Объект исследования
Эксперименты были проведены на малых сусликах (Citellus pigmaeus Pallas) массой 200-250 г, являющихся типичными представителями зимоспящих животных (Калабухов, 1985) и белых беспородных крысах - самцах, весом 180-200 г.
.2 Постановка эксперимента
.2.1 Условия гибернации
Сусликов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан), весной - летом, методом залива нор, и до наступления холодов содержали в условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Для индукции зимней спячки грызунов переводили в темное и неотапливаемое помещение с температурой воздуха, соответствующей температуре вне помещения вивария, и переводили на сухие корма. После снижения температуры воздуха до +8-6С животные укладывались в стеклянные баллоны с подготовленной подстилкой. Ежедневно проверялась активность животных методом опилочной пробы. В торпидном состоянии сусликов исследовали в середине баута.
Для изучения процессов, происходящих в ходе пробуждения сусликов, животных через два месяца после начала гибернации, в середине баута спячки помещали в холодильник для достижения температуры тела 2,5С. После этого сусликов переносили в помещение с температурой 25С для самосогревания. Для экспериментов брали сусликов по достижении температуры тела 10, 20, 25, 30 и 37С.
Температуру тела животных измеряли в прямой кишке через каждые 10-15 мин. Было установлено, что температура тела достигает 10С за 25-30 мин, 20С - за 120-140 мин, а 37С - за 160-180 мин.
На интервале температур 10 и 20С у животных появляется сильная дрожь, значительно учащается пульс и дыхание. После достижения температуры тела сусликов 20С дальше она возрастает очень быстро, при этом животные открывают глаза и поднимаются на лапки, начинают свистеть.
Сусликов исследовали в следующие периоды зимней спячки:
. Бодрствующие, в июле-августе (нормотермия 38С);
. Бодрствующие, в сентябре (нормотермия 38С);
. Перед спячкой, начало октября (tт=16-19С);
. Начало спячки, ноябрь (tт=10-13С);
. Через 1 месяц спячки (tт=5-8С);
. Через 2 месяца спячки (tт=3-4С);
. Через 3 месяца спячки, начало февраля (tт=4-5С);
. Перед пробуждением, март (tт=6-7С).
Исследовали также группу сусликов, не спавших зимой, а содержащихся в условиях вивария на полном рационе и в отапливаемом помещении.
.2.2 Условия искусственной гипотермии
На крысах поставлены следующие опыты:
. Нормотермия (контроль);
. Иммобилизация в течение 1 часа;
. Умеренная гипотермия 33-30С;
. Глубокая гипотермия 20-19С;
. Пролонгирование глубокой гипотермии (20-19С) в течение 2 часов;
. Кратковременная гипертермия 42С.
Контрольную группу составляли животные, содержащиеся в условиях вивария. Гипотермию проводили в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода таким образом, что охлаждение животного до 33-30С наблюдалось через 15-20 минут, а 20-19С достигалось через 50-60 минут, и эта температура поддерживалась при пролонгировании в течение двух часов. Гипертермию проводили в той же камере с добавлением теплой воды, где соответствующая температура достигалась через 15-25 минут. Дополнительным контролем для охлажденных до глубокой гипотерии 20С служили иммобилизованные крысы, содержащиеся в холодовой камере без охлаждения в течение 1 часа.
Температуру тела животных измеряли ректально ртутным термометром, на глубине.
.3 Обработка биологического материала
.3.1 Получение сыворотки
Животное, находящееся в соответствующем состоянии для исследованиия, декапитировали, после чего отбирали кровь, оставляли ее 30 минут при комнатной температуре. Для получения сыворотки кровь центрифугировали 15-20 минут при 3000 об/мин. Полученную сыворотку аккуратно отбирали и переливали в пробирку.
.3.2 Приготовление гомогенатов тканей
Мозг, сердце и печень, выделенные на холоду, промывали в охлажденном физиологическом растворе, удаляли мелкие капилляры, и высушивали фильтровальной бумагой. Далее ткани измельчали, гомогенизировали в соответствующих средах гомогенизации в соотношении 1: 9 (ткань: среда), а затем фильтровали. Полученный фильтрат использовали в эксперименте.
2.4 Методы биохимического анализа
.4.1Определение автолитической активности нейтральных протеаз
При определении автолитической активности нейтральных протеаз по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986) измерения проводили на спектрофотометре СФ 46 при 280 нм.
Метод основан на способности ароматических аминокислот, поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280нм.
.4.2 Определение общей активности нейтральных протеаз
Общую активность нейтральных протеаз определяли модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцова, 1988).
Приготовление субстрата
Взвешивали 1 г казеина и растворяли его в небольшом количестве (25 мл) гидроортофосфата натрия 0.05Н Na2HPO4 и доводят до кипения при постоянном помешивании. Затем в раствор добавляли 0.1 N NaOH, доводя рН до 7.4. Далее к раствору приливают дистиллят с соответствующим значением рН и доводли объем раствора до 100 мл. Дистиллят нужного значения рН также готовили, приливая к нему 0.1 N NaOH.
Состав проб для определения общей активности нейтральных протеаз
К 0.5 мл субстрата приливали 0.5 мл 10% гомогената и помещают на инкуб