Действие экстракта гриба Fusarium на биохимические показатели прорастания семян
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
»и длину корешков, взвешивали общую массу семян в одной чашке Петри. Измеренные семена помещали в чашку Петри на новую фильтровальную бумагу с исследуемым раствором удобрения в количестве 10 мл. В контрольную группу приливали 10 мл дистиллированной воды, ставили в термостат на 24 часа. Через 24 часа делали замеры длины проростков и общей массы проростков и перекладывали семена в чашки Петри на дистиллированную воду для прорастания при естественном освещении. Через 8 суток сделали замеры длины корешков, побегов и общей массы в одной чашке.
Основной момент в прорастающем зерне - начало роста зародыша и его превращение в самостоятельное растение. При прорастании зерна важно наличие влаги, тепла и кислорода. Для прорастания семян ячмень требует 50% воды от массы семян, пшеница -55%, овес - 65%.
Ячмень довольно требователен к теплу [36], начинает прорастать при сравнительно низкой температуре -1 - -3С. Оптимальной считается температура от 18 до 25С. Смена дневных и ночных температур благоприятна для ускоренного прорастания. Препятствовать этому могут неблагоприятные факторы среды (недостаток влаги, низкие температуры, избыточное увлажнение), которые приводят к неполноценному появлению проростков [24].
Наряду с оптимальным количеством влаги и режимом температур для нормального роста зародыша необходим кислород воздуха, который обеспечивает дыхание и ферментные процессы в зерновке. При набухании зерна многие ферменты синтезируются вновь. Одновременно с этим существующие ферменты разрушаются, что означает интенсивную смену ферментативных систем. Это, вероятно, вызывает значительные изменения в метаболизме запасных веществ в тканях. Клетки, которые синтезировали нерастворимые крахмал, белки и липиды, во время развития зерна приступают к гидролизу этих веществ. В результате прорастания резко усиливается действие ферментов зерна, начинается процесс растворения отложенных в эндосперме сложных веществ с образованием более простых. Крахмал превращается в декстрины и мальтозу, белок - в аминокислоты, жир - в глицерин и жирные кислоты. Они служат питанием для развивающегося зародыша. Так запасные белки разрушаются протеолитическими ферментами до растворимых азотистых соединений, которые затем используются различными частями проростка. Количество запасных белков уменьшается с увеличением доли аминокислот и амидов, за счет которых происходит синтез новых белков в растущих частях зародыша. Лишь небольшое количество азотистых веществ накапливается в запасающих тканях, так как в процессе быстрого синтеза новых белков в развивающемся зародыше расходуются имеющиеся азотистые соединения. Сухие зерна содержат лишь некоторые белки, основная их часть появляется в процессе прорастания. Сухая масса зерна в этот период очень сильно понижается, так как зерно теряет большое количество содержащихся в нем органических веществ [21].
2.4 Определение активности каталазы
Каталаза (КФ 1.11.16) широко распространена в растительных тканях. Она обнаружена во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов. Подобно пероксидазе и цитохромоксидазе каталаза относится к Fe-порфириновым ферментам [32].
Сущность каталитического действия каталазы состоит в разложении пероксида водорода с выделением молекулярного кислорода. Реакция с участием каталазы требует двух молекул пероксида водорода, из которых одна действует как донор, а другая как акцептор электронов.
Чане представил следующий механизм каталитической реакции:
Н2О2 > 2Н2О + О2+ НООН > FeOOH + Н2О
FeOOH + НООН > FeOH + Н2О + О2
Пероксид водорода, образующийся в обменных реакциях, в известных концентрациях для клетки токсичен, в связи с чем нельзя недооценивать роль каталазы, активирующей процесс разложения пероксида водорода с образованием воды и неактивного кислорода. Известно, что каталаза проявляет каталитическую функцию независимо от присутствия пероксидазы.
Для определения активности каталазы использовали модифицированный метод, основанный на определении количества Н2О2, не разложившегося после инкубации его с каталазой путем спектрофотометрической регистрации окрашенного продукта реакции взаимодействия пероксида водорода с молибдатом аммония.
В опытной пробе к 1 мл 0,03% пероксида водорода добавляли 0,1 мл частично очищенного цитозоля (гомогенат ткани 1:10, приготовленный на 0,1 М трис-HCl буфере (рН=7,4), центрифугировали 30 минут (3000 g) при 4С и разбавить до разведения 1:500 (0,1 мл + 4,9 мл буфера).
В контрольной пробе вместо пероксида водорода использовали дистиллированную воду. В холостой пробе к Н2О2 вместо биологического материала добавляли 0,1 мл Н2О. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и затем добавляли 0,5 мл 4% молибдата аммония. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 412 нм.
Активность каталазы рассчитывали по формуле:
где Ехол, Еоп - оптическая плотность холостой и опытной пробы;
V - конечный объем реакционной смеси, мл;
? - коэффициент молярной экстинкции, 22200 см-1 М-1;
t - время инкубации пробы, мин;
l - длина кюветы, см;
mткани - масса ткани в реакционной смеси, мг;
Активность фермента выражали в мкмоль/ г ткани.
2.5 Количественное определение суммы фенольных соединений
К 0,2 мл полученного извлечения прибавляли 7,7 мл воды очищенной, 0,1 мл реактива Фолина-Чиокальто и 2 мл 10% ра