Действие экстракта гриба Fusarium на биохимические показатели прорастания семян
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
еществ, простагландин Е2 и его эфиры 0,04-0,1; простагландин F2? и его эфиры 0,03-0,07; фосфолипиды 1,5-3; каротиноиды 0,01-0,03.
Гриб Fusarium sambucin штамм BKMF 3051 D депонирован Всесоюзной коллекцией микроорганизмов ИБФМ АН СССР.
Использование штамма BKMF 3051 D гриба Fusarium sambucinum и использование не только биомассы гриба, но и культуральной жидкости для получения биологически активных веществ позволяет значительно увеличить выход целевого продукта.
Гриб Fusarium sambuc. BKMF 3051 D выращивают в ферментере на среде с мелассой, сахарозой, аммонием азотнокислым, калием фосфорнокислым однозамещенным при температуре 26оС с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин, аэрацией 1 л/л/мин в течение 32-72 ч. Затем биомассу и культуральную жидкость разделяют путем фильтрования на нутч-фильтре. Культуральную жидкость водный экстракт стабилизируют добавлением 7% по объему этилового спирта и получают продукт, содержащий коллагеназу, фосфолипиды, простагландины Е2 и F2?.
Биомассу смешивают с 96% -ным этиловым спиртом в соотношении 1:1,5 (масса/объем) и выдерживают при комнатной температуре в течение 48 ч. Смесь фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме до 1/7 от начального объема при температуре не выше 450С. Водно-спиртовый остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до рН 4,0-4,5 и экстрагируют хлороформом 3 раза. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают в вакууме досуха при температуре 40-450С. Остаток, содержащий БАВ, растворяют в 96%-ном этиловом спирте в соотношении 1:5 (масса/объем) и хранят в холодильнике от 0 до 50С. Биомассу после первой экстракции еще три раза последовательно инкубируют в среде с 82%-ным этанолом в соотношении 1:2 в течение 7 сут. извлекая БАВ органическими растворителями, как описано выше. Спиртовые растворы БАВ объединяют и анализируют на их количественное содержание.
Методом газожидкостной хроматографии качественно и количественно определяют содержание простагландинов Е2 и F2?. Анализ проводят на хроматографе Газхром 1109 с модифицированным детектором электронного захвата (ионизационно-резонансным). Используют стеклянную колонку длиной 2 м, диаметром 3 мм, заполненную силанизированным сорбентом хроматоном NAW-DMCS c нанесенной жидкой фазой 1% SE-30. Условия анализа: температура колонки 2100С, температура детектора 2300С, температура испарителя 2750С, скорость газа-носителя (азот особой чистоты) 30-35 мл/мин. Время удерживания для ПГF2? 23 мин и для ПГВ2 7,5 мин. Количество простагландинов Е2 и F2? рассчитывают по площади пиков по сравнению со стандартными образцами [23].
Определение количества ПГЕ2 проводят также по методу Bygdeman путем щелочной изомеризации в ПГВ2 и измерением оптической плотности методом УФ-спектрофотометрии на спектрофотометре при длине волны 278 нм и расчете по калибровочной кривой [13].
Строение простагландинов подтверждают методом хромато-масс-спектрометрии на масс-спектрометре "Hewlett Packard 5985 B" c квадрупольным масс-анализатором в режиме непрерывного сканирования при ионизации электронным ударом с энергией 20 эВ. Условия хроматографии: стеклянная капиллярная колонка длиной 25 м, диаметром 0,25 мм, покрытая неподвижной метилсиликоновой фазой СР-СИЛ-5. Температура 180-3200С, 50С /мин. Скорость газа-носителя (гелия) 36 мл/мин. Идентификацию хроматографических пиков осуществляют по времени удерживания и характерным фрагментам в масс-спектрах, используя каталог (ESA/BXK Mase Spectral Date Base, Washington). ПГЕ2 время удерживания 16,7 мин; ПГF2? 16,3 мин.
Масс-спектры: ПГЕ2 m/e: 510 M+, 495 (M-15), 439 (M-71), 420 (M-90), 349 (M-71-90), 225, 205, 199, 173.
ПГF2? m/e: 584 M+, 569 (М-15), 513 (М-71), 494 (М-90), 423 (М-71-90), 333 (М-2х90), 243, 217, 191, 173.
Количество фермента с коллагеназной активностью определяют спектрофотометрическим методом по поглощению при длине волны 590 нм, расчет проводят по калибровочной кривой [14].
Количественное определение фосфолипидов проводят методом УФ-спектрофотометрии, измеряя величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 820 нм.
Для определения содержания фосфолипидов значение содержания фосфора умножают на 25. Коэффициент 25 учитывает соотношение атомного веса фосфора и молекулярного веса фосфолипидов [34].
Каротиноиды определяют после выделения их из целевого продукта препаративной ТСХ на силикагеле в системе: петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота 80: 20:1. Зону с Р 0,78-0,80 элюируют 2 мл хлороформа. К элюату добавляют 2 мл 33%-ного раствора хлорида сурьмы, 0,3 мл уксусного ангидрида и определяют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при длине волны 620 нм [32].
Биологически активная добавка к пище, получаемая из грибов, обладает широким спектром биологического действия и не только стимулирует иммунную систему организма, но и через наличие ?-глюкана стимулирует образование интерферонов, глобулинов и фактора некроза опухолей в организме.
2. Материалы и методы экспериментальных исследований
.1 Характеристика объекта исследований
Эксперимент поставлен на семенах злаковой культуры ячменя ярового. Семена были разделены на 4 группы: 1 группа (n=3) - контроль (семена замачивали в воде), 2 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:1000, 3 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:10000, 4 группа (n=3) - семена замачивали в экстракте гриба Fusarium sambucinum с разведением 1:100000.
Ячмень имеет сложный химический состав, который зависит от сорта, района произрастания, метеорологических и почвенных условий, массового соотношения отдельных частей зерна. Так, масса зародыша колеблется от 2,8 до 5%, цветочных плен