Хроматографическое разделение углеводов
Информация - Разное
Другие материалы по предмету Разное
ительность проявления увеличивают или проводят двукратное или трехкратное проявление с высушиванием пластинки между ними или двукратное проявление в перпендикулярных направлениях (двумерная хроматография). Длительность проявления определяется характером растворителя: для проявления пластинки размером 20x20 см неполярными растворителями достаточно 2030 мин, тогда как при проявлении полярными растворителями, содержащими воду, необходимо 12 ч.
После высушивания пластинки можно приступать к обнаружению пятен.
Методы обнаружения, не вызывающие деструкции анализируемых веществ.
Если компоненты- смеси окрашены (что, как правило, нехарактерно для углеводов), их легко обнаружить визуально. Некоторые производные сахаров обнаруживают по флуореiенции в ультрафиолетовом свете. Если сами вещества не флуореiируют, к сорбенту можно добавить флуореiентный индикатор, например смесь силиката и сульфида цинка, или воспользоваться коммерческим сорбентом, уже содержащим индикатор смесь марганца и активированного силиката цинка. В этом случае сахара проявляются в УФ-свете в виде темных пятен на светящемся фоне. Иод, родамин В, бромтимоловый синий, 2',7'-дихлорфлуореiеин, вода реагенты, позволяющие обнаружить сахара, не разрушая их.
Методы обнаружения, вызывающие деструкцию анализируемых веществ.
Все реагенты, используемые для обнаружения компонентов сахаров на бумажных хроматограммах (кроме реагентов, требующих промывки хроматограмм), пригодны и для тонкослойной хроматографии.
Кроме того, в ТСХ можно использовать и такие реагенты, как концентрированная серная кислота. При прокаливании пластинки, опрысканной кислотой, сахара обугливаются. Как правило, пластинку слабо опрыскивают 550%-ным раствором серной кислоты в воде или спирте и нагревают 10 мин при 130С. При подобной обработке цвет сорбента не изменяется.
Для обнаружения углеводов используются также реагенты, дающие цветные реакции с сахарами и их производными:
1) анисовый альдегид + серная кислота;
2) нафторезорцин +серная кислота
3) нафторезорцин +фосфорная кислота (кетозы дают красное окрашивание, альдозы - синее);
4) азотнокислое серебро + основание;
5) кислый анилинфталат;
6) о-аминодифенил + ортофосфорная кислота;
7) дифениламин + анилин + фосфорная кислота;
8) п-анизидинфталат или хлоргидрат н-анизидина (гексозы дают зеленое окрашивание; пентозы фиолетово-красное; 6-дезоксигексозы желто-зеленое; уроновые кислоты коричневое);
9) мочевина + фосфорная или соляная кислота;
10) хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий;
11) бихромат калия + серная кислота;
12) азотнокислое железо(III) +солянокислый гидроксиламин;
13) перманганат калия + едкий натр;
14) карбазол + серная кислота;
15) димедон + ортофосфорная кислота (кетозы дают серо-зеленое окрашивание);
16) фенол+серная кислота;
17) тимол + серная кислота;
и многие другие.
3.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Тонкослойная хроматография находит все большее применение для количественного определения углеводов. Этот метод чрезвычайно полезен при изучении кинетики реакций, исследовании их механизма и определении выхода продуктов, однако он применим лишь для анализа смесей, компоненты которых можно полностью разделить. Способы количественного определения делят на две большие группы:
а) прямое определение (установление количества вещества непосредственно на пластинке);
б) косвенное определение (элюирование пятен вещества с последующим анализом элюата физическими методами).
Для прямого определения используются денситометрия и радиометрия элюатов. Обе группы методов требуют построения калибровочных кривых, связывающих концентрацию компонента с интенсивностью окраски, степенью поглощения или уровнем радиоактивности соединения.
Если на каждом этапе анализа соблюдаются все меры предосторожности, точность описанных ниже методов составляет 35%. Измерение интенсивности окраски сахара или продуктов его распада непосредственно на хроматограмме производится методом денситометрии. Ввиду того, что сами сахара не окрашены, их обрабатывают реактивом, вызывающим появление окрашенного пятна на фоне слоя сорбента. Цвет последнего, как правило, не изменяется (белый). Если сорбент все-таки окрашивается, необходимо, чтобы окрашивание было. Пятна должны иметь четко очерченные границы и не должны выцветать. Даллас, а также Шеллард и Алам подробно рассмотрели факторы, влияющие на точность и воспроизводимость результатов анализа
Чтобы оценить содержание сахаров в образце, можно также сфотографировать хроматограмму (или сделать фотокопию) и, разрезав поученный снимок на полосы, просканировать их на денситометре.
Сахара, несущие радиоактивную метку, количественно определяют непосредственно на хроматограмме с помощью iетчика радиоактивности или радиоавтографическим методом путем денситометрического сканирования рентгеновского снимка хроматограммы.
После вымывания сахара проводят либо прямую оценку его количества, либо предварительно обрабатывают его подходящим реактивом, а затем измеряют поглощение в УФ- или видимом свете. Трудности возникают в тех случаях, когда с сорбента элюируются посторонние вещества, мешающие измерению поглощения. Чтобы исключить возможные ошибки, необходимо тем же способом иследовать элюат образца сорбента, взятого на уровне пятна.
Сахара, несущие радиоактивную метку, количестве?/p>