Хроматографическое разделение углеводов
Информация - Разное
Другие материалы по предмету Разное
в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов хранят в бутыли из темного стекла, откуда он и подается в систему при помощи поршневого насоса. Между насосом и тройником, в котором происходит смешение элюата с раствором красителя, расположено устройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления (рис. 4). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеевик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, погруженный в термостатируемую полигликолевую баню (100С). Время нахождения смеси в змеевике около 10 мин. Интенсивность окраски раствора определяется спектрофотометрически при 420 нм проточных кюветах с l 215 мм. Удобно пользоваться системой из двух последовательно соединенных кювет разной длины: если на более длинной кювете самописец зашкаливает, измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм удается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На колонках меньшего или большего диаметра можно проанализировать соответственно меньшее или большее количество смеси.
Достоинством вышеописанной схемы анализа является высокая точность количественного определения и отсутствие необходимости в частом построении калибровочных кривых (при постоянстве условий анализа). Если удается достичь полного разделения компонентов, отклонение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет 1енее 1%. Однако весь элюат расходуется за одно определение, и потому не удается провести дополнительное исследование фракций.
Если проводится препаративное разделение или если проводимые исследования требуют повторного разделения и дополнительных анализов компонентов смеси, то для разделения потока элюата и введения растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Такая схема анализа (рис. 5) отличается большей гибкостью, однако недостатком ее является более низкая точность количественных определений в связи с тем, что соединительные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней.
Рис. 5. Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих сахаров и альдитов.
М- сместители; Р1 и Р2 гасители пульсации; L флуореiентная лампа трубки; А орционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная кислота; В периодат-формальгидный канал: 0,015Мметапериодат натрия, содержащий 5 мл конц. соляной кислоты на литр
На рис.5 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат делится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрасывается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров периодатным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются периодатом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D-фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода.
6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивидуальных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. Существует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичественный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение максимальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи iетчика Гейгера Мюллера.
Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества.
Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%.
7. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ТРИМЕТИЛСИЛИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ САХАРОВ
Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных углеводов представляет собой хорошо отработанный метод, который в течение ряда лет используется для анализа сложных смесей сахаров, таких, как кукурузная патока или в общем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие ф