Хроматографическое разделение углеводов
Информация - Разное
Другие материалы по предмету Разное
азы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров.
Этот метод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увеличивает устойчивость триметилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой избыток реагента. Поэтому стандартная калибровочная смесь устойчива в течение нескольких месяцев, что весьма важно для хранения контрольных образцов редких олигосахаридов.
8. ГАЗОЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ МЕТИЛИРОВАННЫХ САХАРОВ
Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют.
Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов.
Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущих детекторам, или следствием потерь некоторых компонентов при подготовке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Твердые правила выбора колонки еще не выработаны. Тем не менее изучение литературных данных показывает, что большинство исследователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, дают лучшее разрешение всех типов производных метилированных сахаров. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избежать расхождений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до 2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до 5%.
Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 7090 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа.
Заключение
Хроматографические методы при разделении и очистке полисахаридов, так же как и в других областях химии природных соединений, играют исключительно важную роль. Однако вследствие своеобразия полисахаридов далеко не все разновидности хроматографии используются в равной мере. Наличие даже в очищенных полисахаридах набора полимерогомологов с близкой хроматографической подвижностью и близкими сорбционными свойствами, их коллоидный характер, а также склонности к ассоциациям все это обусловливает малую эффективность таких видов хроматографии, как бумажная, распределительная и адсорбционная хроматография.
Вместе с тем ионообменная хроматография имеет исключительно важное значение при разделении и очистке полисахаридов.
Широко применяемые ДЭАЭ-целлюлоза и эктеолацеллюлоза позволяют легко отделить нейтральные и кислые полисахариды: нейтральные обычно не задерживаются или мало задерживаются на названных анионитах, кислые, в зависимости от своей природы, более или менее прочно удерживаются и элюируются растворами солей, буферными растворами или щелочами. На анионитах разделяются различные кислые полисахариды в зависимости от степени их кислотности. Применение ДЭАЭ-целлюлозы в боратной форме позволяет разделять и нейтральные полисахариды. Недавно были разделены нейтральные полисахариды (гликоген) при помощи ДЭАЭ-целлюлозы на фракции, отличающиеся величиной частиц./3/
Для разделения сахаров применяются следующие методы:
- Хроматография на колонках с углем применяется для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации (моносахариды, дисахариды, трисахариды т. д.).
- Хроматография на колонке iеллюлозой имеет широкую область применения, что нет необходимости рас