Хроматографическое разделение углеводов
Информация - Разное
Другие материалы по предмету Разное
?но определяют в элюате при помощи жидкостного iинтилляционного iетчика. Высокая точность оценки достигается даже в тех случая, когда сорбент (~0,1 г) попадает в ампулу iетчика (15 мл).
МЕТОДИКА
ПРЯМОЕ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ (на примере использования кукурузной патоки). Анализ проводится на стеклянных пластинках со слоем силикагеля толщиной 0,5 мм. Пластинки используются сразу после получения. Образцы кукурузной патоки с известным содержанием твердого остатка разбавляют водой до концентрации 1 % (по этому остатку). С помощью шприца на 25 мкл, снабженного дозатором, полученный раствор наносят на пластинку полосами шириной 6 мм, содержащими от 5 до 90 мкг твердого вещества. Чтобы полосы были узкими, их подсушивают током теплого воздуха. (если образец растворяют в каком-либо органическом растворителе, раствор при подсушивании может ползти по внешней стороне иглы шприца, что приводит к потере вещества при нанесении). На каждой пластинке помещается 12 полос: 6 контрольного сиропа и 6 анализируемого.
Пластинку проявляют в подходящей системе растворителей при ~25С; фронт растворителя должен подняться на 12 см от стартовой линии. Мальтоолигосахариды вплоть до декасахарида можно разделить в системе этилацетатметанолвода (37:40:23 по объему), однако этот проявитель эффективен лишь для пластинок с силикагелем F-254.
Несколько изменив состав проявителя, его можно применять и с другими сорбентами.
Пластинку высушивают в токе теплого воздуха, опрыскивают 50%-ной серной кислотой и прокаливают при 120 С для обнаружения пятен. Чтобы полученные результаты были воспроизводимыми, пластинка должна быть равномерно опрыскана мелкими капельками распыляемой жидкости.
Количественную оценку состава смеси проводят методом трансмиссионной денситометрии на денситометре, снабженном самопиiем и интегратором для определения площади каждого пика.
Пластинку сканируют в горизонтальном направлении так, что сначала регистрируются все моносахариды, затем дисахариды и т. д. Для определения площадей пиков можно также использовать планиметр. Количество каждого компонента определяют по отношению к соответствующему сахару в стандартном образце путем сравнения площадей пиков. В данном случае необходимость в использовании фильтра к лампе денситометра отсутствует.
При использовании в качестве проявителя смеси (3:4:2 по объему) этилацетат метанол вода, которая позволяет получить четкое разделение высших сахаров, рассматриваемый метод обеспечивает высокую точность результатов (табл.4).
Таблица 4. Состав кукурузной патоки
определенный методом бумажной и тонкослойной хроматографии
Сахариды, %монодитритетрапентагексагептаоктанона + высшиеОбычная патока (43 экв. глюкозы)БХ20,515,411,39,87,76,04,73,921,5ТСХ20,114,611,8,67,25,44,93,423,9Станд. отклонение для ТСХ0,70,510,400,300,370,350,110,200,41Патока с низким содержанием глюкозы и высоким содержанием мальтозы (43 экв. глюкозы) БХ6,834,417,29,42,32,62,44,020,0ТСХ7,335,117,58,52,52,42,02,821,6Станд. отклонение для ТСХ1,254,363,100,660,701,100,770,651,33Патока с высоким содержанием глюкозы и мальтозы (70 экв. глюкозы)БХ41,141,43,24,83,81,82,4-1,6ТСХ40,842,13,53,12,71,52,4-3,1Станд. отклонение для ТСХ1,251,621,280,650,260,370,78-0,32
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ (косвенный метод) Однородную суспензию 100 г восстановленной боргидридом микрокристаллической целлюлозы в 430 мл воды наносят при помощи аппликатора слоем толщиной 0,5 мм на стеклянные пластинки размером 20х20x0,4 см. Пластинки сушат при 25 С примерно 12 ч, после чего на них шприцем наносят по 1,25 мкл растворов сахаров. Если требуется нанести больший объем, операцию проводят в несколько приемов, подсушивая пластинку в промежутках, до тех пор, пока в пятне не окажется от 10 до 150 мкг сахара. После высушивания пластинку проявляют в течение 75 мин смесью этилацетат - пиридин - вода (2:1:2). Проявленную хроматограмму снова высушивают и равномерно опрыскивают раствором кислого анилинфталата (1,66 г о-фталевой кислоты и 0,91 мл чистого анилина растворяют в смеси 48 мл м-бутанола, 48 мл эфира и 4 мл воды). Пластинку выдерживают 57 мин при 105110С. (Внимание! Эфир.) Прямоугольные участки слоя вокруг пятен вырезают острой лопаточкой и сорбент количественно переносят с пластинки в пробирку. Размер вырезанных участков должен быть одинаковым для всех пятен одного и того же сахара. На уровне пятна сахара с пластинки берут пробу сорбента для холостого опыта. В пробирки добавляют по 0,5 мл раствора кислого анилинфталата и выдерживают 1 ч при 105110С. (Внимание! Эфир.) После охлаждения твердый остаток растирают тонкой стеклянной палочкой, добавив к нему 4 мл элюирующей смеси (4 мл концентрированной соляной кислоты в 100 мл ацетона). Пробирки закрывают тефлоновыми пробками и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Осадок отделяют центрифугированием (3 мин), супернатанты переносят шприцем в кварцевые кюветы с l =1 см и на спектрофотометре измеряют оптическую плотность растворов относительно раствора холостого опыта при 390 нм для гексоз и 360 нм для пентоз. Зависимость оптической плотности от концентрации D-глюкозы, D-галактозы, D-маннозы, 6-дезокси-L-маннозы (L-рамнозы), D-арабинозы и D-ксилозы имеет линейный характер. Для D-ксилозы и D-глюкозы линейность сохраняется в интервале от 0 до 150 мкг. Количество сахара в образце определяют по калибровочной кривой, построенной для известных сахаров, которые были нанесены на ту же пластинку, что и анализируемая смесь. Для смесей, содержащих 20100 мкг каждого сахара, точность определения составляет 3%.
4. ПРЕПАРАТИВНАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМА