Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
экранировавшие сайт TEV.
Таблица 2
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF165
Этапы очисткиОбщий белок (мг)Содержание ГБ (%)Содержание hVEGF165 (%)Осветлённый клеточный лизат11715Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose14.890Расщепление ГБ TEV протеазой14.834
Получение гибридного белка CBD-hVEGF165
Высокий уровень экспрессии гибридного белка Trx-hVEGF165 подтвердил правильность выбранного способа продукции целевого белка. Однако, трудности возникшие на стадии сайт специфичного протеолитического расщепления TEV протеазой были, скорей всего, вызваны специфической природой тиоредоксина, влияющего на фолдинг молекулы гибридного белка. В результате снижалась доступность сайта TEV для TEV протеазы. Поэтому мы решили использовать в качестве лидерного полипептида белок с принципиально другой структурой, а также обладающего небольшой молекулярной массой в сравнении с молекулой тиоредоксина. Таким образом, было решено создать конструкцию, содержащую на N конце хитинсвязывающий домен (CBD) соединённый с hVEGF165 через сайт TEV.
CBD фрагмент амплифицировали с pTWIN1 с помощью праймеров Т7-prim и CBD2, содержащими сайты рестриктаз Xba I и Bgl II соответственно. В качестве вектора была выбрана плазмида pET-32b(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции Xba I и Bgl II (Рис. 19), по которым и была произведена вставка амплифицированного фрагмента с учетом корректной рамки считывания (Рис. 18).
Рис. 18. Схема получения плазмиды pET-CBD
Рис. 19. Полилинкерная последовательность вектора pET-32b(+).
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора клонов.
Отбор клонов осуществляли по результатам данный полученных при электрофорезе клеточных лизатов клонов в ПААГ. (Рис. 20).
Рис. 20. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/ pET-CBD
Из отобранных клонов выделили плазмидную ДНК для дальнейшей работы.
Получение экспрессионного вектора pCBD-VEGF165.
Ранее полученный ген человеческого VEGF165 был амплифицирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Xho I, в качестве матрицы использовали плазмиду pTVG-VEGF165.
Амплифицированый ген hVEGF165 был клонирован по сайтам Xho I и Bgl II в ранее созданную для этого генетическую конструкцию pET-CBD. В результате получили плазмиду pCBD-VEGF165 (Рис. 21).
Рис. 21. Схема получения плазмиды pCBD-hVEGF165
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, iелью отбора клонов. В результате было проверенно 9 клонов на наличие экспрессии гибридного белка (Рис. 22).
Рис. 22. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/pCBD-hVEGF165. Где А - гибридный белок CBD-hVEGF165
Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).
Из биомассы клона №4 была выделена плазмида pCBD-VEGF165 для дальнейшей работы.
Получение штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF165
Выделенной плазмидой pCBD-VEGF165 трансформировали клетки E. coli Origami (DE3). Полученный штамм продуцент проверяли на наличие продукции гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях iелью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма в невосстанавливающих условиях показала наличие димера химерного белка (Рис. 23). Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы клетки E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 в основном присутствовал в растворённой фракции. Таким образом, нам удалось избежать образования телец включения, характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli.
Рис. 23.Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF165, B- мономер гибридного белка CBD-hVEGF165.
Подбор условий культивирования штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165
В ходе дальнейшей работы был проведен подбор оптимальных условий культивирования штамма-продуцента. Для этого в процессе культивирования клеток после добавления ИПТГ каждый час отбирались пробы биомассы. Культивирование проводили при 30о С.
Результаты данного эксперимента представлены на рис. 24.
Рис. 24. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) образцов биомассы E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF165после индукции ИПТГ. Где А - гибридный белок CBD-VEGF165.
Из полученной электрофореграммы видно, что оптимальное время культивирования клеточной культуры E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 15-16 часов после добавления ИПТГ.
Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF165.
Полученный продуцент E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 культивировали при 37 0С до оптической плотности 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали при 30 0С в течение 16 часов.
Биомассу штамма-продуцента E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 подвергали ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Используя сродство VEGF165 к гепарину, гибридный белок, содер