Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
66 была незначительной.
В статье (Hyo Jin Ihm, et al., 2008) была предложена стоп старт конструкция для бактериальной системы экспрессии косного морфогенного белка. Авторы отмечали высокий уровень экспрессии BMP-2 за счёт сопряжённой транскрипции мРНК BMP-2 с тиоредоксином. На подобии описанной в литературе конструкции было решено клонировать ген hVEGF165 под стоп кодон тиоредоксина. Кодирующая последовательность тиоредокцина была взята из вектора pET32b+. В кодирующую последовательность тиоредоксина была встроена по сайтам EcoR I и Hind III вставка TRX_STOP. Вставка содержала стоп кодон ТАА, старт кодон ATG и следующий за ним сайт рестрикции Sap I.
Рис. 9. Схема вставки TRX_STOP
Рис. 10. Схема клонирования вставки Trx STOP в вектор pET32b+
Полученную последовательность тиоредоксин TRX_STOP переклонировали по сайтам Nde I и Xho I в вектор pTTS, производный вектора pTWIN1 (Рис. 11).
Вектор pTTS был получен из коммерчески доступного вектора pTWIN1. Из вектора pTWIN1 был удалён участок фланкированный сайтами Xba I и Bam HI и по образовавшимся липким концам была лигирована вставка, содержащая сайт рестрикции Xho I (Рис. 12).
Рис. 11. Схема олигонуклеотидной вставки TTS
Рис. 12. Схема получения плазмиды pTTS
Амплифицированный ген TrxSTOP был клонирован в вектор pTTS по сайтам рестрикции Xba I и Xho I (Рис.13).
Рис. 13. Схема получения плазмиды pTTS-TrxSTOP
Из плазмиды pTTS-TrxSTOP был вырезан фрагмент фланкированный сайтами Sap I и Xho I. По образовавшимся липким концам лигировали амплифицированный ген hVEGF165. В итоге, была получен плазмидный вектор pTTS-VEGF165 (Рис.14).
Рис. 14. Схема получения плазмиды pTTS- VEGF165
Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и высеивали на твёрдую питательную среде LB Agar, содержащую 100 мкг/мл ампицилина. Полученные колонии рекомбинантов анализировали на содержание и уровень экспрессии тиоредоксина и hVEGF165 методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. На основании данных SDS ПААГ электрофореза были отобраны клоны №2,3 для дальнейшей работы.
Рис. 15. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов различных клонов E. coli ER2566/ pTTS- VEGF165. Где A-h VEGF165, B-тиоредоксин.
Из клонов №2, 3 выделили плазмидную ДНК (pTTS-hVEGF165). Плазмидной ДНК клона № 2 (pTTS-hVEGF165) трансформировали клетки E. coli ER2655 и осуществили наработку биомассы ER2566/pTTS-hVEGF165. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветлённый лизат после центрифугирования хроматографировали на анионообменной смоле Q Sepharose (GE Healthcare). Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях на наличие целевого белка. Фракции, содержащие 90% hVEGF165, были объединены. В объединенных фракциях методом Бредфорд определяли концентрацию белка. В результате конечный выход целевого белка составил 7 мг с литра культуры. Не смотря на низкий выход целевого белка, продукция тиоредоксина была значительной, что отчётливо видно на хроматограмме. (Рис.15).
Таблица 1
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы E. coli ER2566/ pTTS- VEGF165.
Этапы очисткиОбщий белок (мг)Содержание ГБ (%)Содержание hVEGF165 (%)Осветлённый клеточный лизат47310Ионообменая хроматография на сорбенте Q XL2190
Получение гибридного белка Trx-hVEGF165
На основании результатов ранее описанного эксперимента по получению hVEGF165 с помощью стоп старт конструкции было решено осуществить получение hVEGF165 в виде химерного белка. Так как уровень продукции тиоредоксина, несмотря на низкий выход hVEGF165, был, достаточно, высокий.
В качестве экспрессионного вектора решили выбрать ранее полученный в лаборатории вектор pTVG производный вектора pET32 b(+). Вектор pTVG содержит ген тиоредоксина, последовательность кодирующую сайт TEV протеазы и удобный полилинкер. Ген hVEGF165 был клонирован в плазмиду pTVG по сайтам Xho I и Nco I. В результате получили плазмиду pTVG-VEGF165 (Рис. 16). В качестве штамма носителя взяли E. coli Origami (DE3).
За счёт делеций гена глутатион редуктазы (gor522) и тиоредоксин редуктазы (trxB) биосинтез hVEGF165 в штамме Origami (DE3) идёт с образованием внутри и межмолекуляных дисульфидных мостиков стабилизирующих молекулу белка и способствующие правильному фолдированию молекулы.
Рис. 16. Схема клонирования hVEGF165 в pTVG
Данной плазмидой трансформировали клетки Origami (DE3) и осуществили наработку биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF165. Полученную биомассу дезинтегрировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветленный лизат хроматографировали на колонке HiTrap Heparin Sepharose. За счёт наличия на С конце молекулы VEGF165 25 аминокислотных остатка, несущих сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010) было решено фракционировать белки осветленного клеточного лизата на гепарин сефарозе.
Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Объединяли фракции, в которых содержание ГБ превышало 90%. Фракции, содержащие ГБ концентрировали методом ультрафильтрации на мембране YM 30. К концентрату, содержащему гибридный белок, была добавленная TEV протеаза в соотношении субстрат - фермент 100:1 соответственно. Протеолитическое расщепление было не значительным, менее 40% (Рис. 17.).
Рис. 17. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Результаты протеолитического расщепления ГБ TEV протеазой. Где A- гибридный белок (Trx-hVEGF165), B-тиоредоксин.
Вероятной причиной низкого уровня протеолитического расщепления были неспецифические взаимодействия hVEGF165 с тиоредоксином,