Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
жидкость опухоли (Senger et al., 1983). Поэтому он получил название сосудистый фактор проницаемости (VPF). Другими исследователями был охарактеризован фактор ответственный за ангиогенез получивший название VEGF. Впоследствии было установлено, что VEGF и VPF идентичны. VEGF является мультифункциональной молекулой, обладающей разнообразным спектром биологической активности, зависящей от стадии развития и физиологической функции органа, в котором он экспрессируется (Leung et al., 1989).
.1.2 Семейство васкулярных эндотелиальных факторов роста(vascular endothelial growth factor) - cосудистый эндотелиальный фактор роста - семейство структурно близких между собой белков: VEGF-A, -B, -C, -D, -E и плацентарного ростового фактора (placenta growth factor, PlGF) (Otrock et al., 2007). Эти биологически активные белки влияют на развитие кровеносных сосудов и обладают общей структурной архитектурой, несмотря на малую степень гомологии первичных последовательностей. Они имеют общую структуру цистеинового узла (Shalini Iyer and K.Ravi Acharya, 2011).
Представители семейства VEGF проявляют биологическую активность в виде димеров: главным образом в виде гомодимеров и иногда в виде гетеродимеров (Bonnie et al., 2009). Биологическая активность VEGF реализуется за счёт связывания с тремя высокоаффинными тирозинкиназными рецепторами: рецептор сосудистого эндотелиального фактора (VEGFR)-1, 2 и 3 (Rosana et al., 2008). Рецепторы VEGFR-1 и VEGFR-2 участвуют в росте кровеносных сосудов, а VEGFR-3 в процессах гематопоэза и лимфоангиогенеза. Кроме трех тирозиновых киназ (VEGFR-1,2,3) изоформы VEGF-А, VEGF-В и PlGF обладают сродством к семафориновым рецепторам (NRP, semaphoring receptor neuropilin) 1 и 2. VEGF-Е (вирусный VEGF) способен связываться с NRP-1, хотя у него отсутствует гепарин-связывающий домен. Некоторые изоформы также связывают гепарансульфат содержащие протеогликаны. Также известно, что разные VEGF и рецепторы VEGF формируют комплексы с интегринами и компонентами внеклеточного матрикса (Ferrara , 2010).
.2 Сосудистый эндотелиальный фактор роста - А
VEGF-А является наиболее мощным и основным регулятором ангиогенеза и васкулогенеза. VEGF-А, высоко специфичный митоген для сосудистых эндотелиальных клеток, способствующий высвобождению белков из кровеносных сосудов, ассоциированных с опухолью. Делеции генов, кодирующих VEGF-А, приводят к серьезным дефектам и неправильному развитию сердечно-сосудистой системы. Гипоксия является главным активатором экспрессии VEGF-А и, как полагают, управляет ангиогенезом во время развития органов. С другой стороны, ограничение/уменьшение доставки VEGF-А к тканям приводит к задерживанию развития органов.
VEGF-А существует в восьми изоморфных формах: VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206, образуемых в результате альтернативного сплайсинга мРНК, которая состоит из 8-ми экзонов. Эти изоформы отличаются в способности связывать гепарин- и гепаран-сульфат.
VEGF-А экспрессируется in vivo в пространственно- временной связи с физиологическим ангиогенезом, а также и с опухолевым. Экспрессия VEGF-А стимулирует образование везикуло-вакуолярных органелл, которые служат каналом для переноса белков крови в опухоли.
Рис. 1. Изоформы VEGF-А, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК VEGF-А.
Показаны домен, гомологичный PDGF (PDGF homology domain) (оранжевый), гепарин-связывающий домен (heparin-binding domain) (светло синий) и NRP связывающий домен (NRP-binding domain) (синий) (Shalini Iyer and K. Ravi Acharya 2011).
Они формируют внесосудистый фибриновый гель, который стимулирует эндотелиальные и опухолевые клетки к пролиферации и миграции, а также помогает стромальным клеткам проникать в растущие опухоли. Взаимодействие лиганда с рецептором запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию (Bonnie et al., 2009).
При активации рецепторов VEGFR участвуют также вспомогательные белки FRS2, которые так же, как и в случае FGFR рецептора, фосфорилированные по тирозиновым и серин-треониновым остаткам, связывают адапторные белки Grb2 и Shp2 (тирозин-фосфатазу) и запускают внутриклеточную сигнальную последовательность PKC (протеин-киназа С), PI3K, Src и Crk (Matsumoto and Mugishima, 2006).
Рис. 2. Связывание VEGF с рецептором VEGFR, запуск сигнальной последовательности
.3 Васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF165)
Изоформа VEGF165 была первым идентифицированным членом семейства васкулярных эндотелиальных факторов роста. VEGF165 является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях. VEGF165 транскрибируется в виде 191 членного полипептида, но затем сигнальные 25 первых аминокислотных остатка специфически отщепляются протеиназой. Зрелый белок состоит из 165 аминокислотных остатка первые 115 участвуют в образовании цистеинового узла и ответственны за связывание с рецептором. С концевые 25 аминокислотных остатка не участвуют в рецепторном взаимодействии, а несут сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010).
Биологически активной формой данного белка является гомодимер, каждых мономер имеет один сайт гликозилирования (Asn 75) с молекулярной массой 19165 Да, pI 7,429, образован семью ?-складчатыми листами, и двумя ?-спиралями, соединенных тремя дисульфидными мостиками (Muller et al., 1997).
Рис. 3. Модель димера VEGF165 (Muller et al., 1997)
Необычная структура внутримолекулярных цистеиновых мостиков получила название мотив Цистеиновый узел представленна на рис 4.
Рис. 4. схема фактора роста содержащего мотив Цистеиновый узел (Shalini Iyer and K. Ravi Acharya 2011)
При расщеплении VEGF165 плазмино