Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
Вµстве продуцентов эукариотические системы экспрессии. Такие как клеточные линии насекомых и ооциты китайских хомячков. Lee Seong-Baek с соавторами была описана методика получения rhVEGF165 в ооцитах китайских хомячков (Lee Seong-Baek et al., 2008). Авторами была достигнута сверхпродукция целевого белка, составившая более 80 мг/л, и разработана методика выделения, включающая последовательные стадии хроматографической очистки. Выход белка после стадий очистки составил 48%.
Особенностью эукариотической экспрессии в отличии от прокариотической является то, что продуцируемый белок экскретируется в питательную среду, и не образует телец включения, таким образом, не требуется дальнейшая процедура экстракции с последующей ренатурацией. Таким образом, количество стадий до получения чистого белка сводится к минимуму. В приведённом обзоре (Lee Seong-Baek et al., 2008) стадия очистки была реализована в два этапа. Первым этапом хроматографической очистки была ионообменная хроматография на сорбенте HiTrap-SP (Amersham Biosciences). Фракции, содержащие rhVEGF165, были дочищены на колонке HiTrapHeparin HP (Amersham Biosciences). В результате чистота белка составила 96%.
Отличие рекомбинантного белка полученного из CHO, от клеток насекомых, заключалось в структуре олигосахаридов и степени гликозилирования, которые наблюдались на SDS-PAGE электрофорезе.
В статье (Geum Young Lee et al., 2006) была представлена методика получения rhVEGF165 в клетках насекомых. В них также как и в клетках млекопитающих осуществляются эффективное гликозилирование, димеризация за счёт образования межмолекулярных дисульфидных связей и секреция целевого белка в культуральная среду. В качестве клеток продуцентов авторы использовали клеточные линии Spodoptera frugiperda Sf21. Ген был получен из клеточной линии карциомы яичников и клонирован в бакуловирусную систему экспрессии. Экспрессия целевого белка составила 20 мг на литр среды. Полученный белок очищали от компонентов культивационной среды трёхступенчатой хроматографией. Первый шаг включал в себя аффинную хроматографию на гепарин сефарозе. Элюат, содержащий целевой белок был сконцентрирован на центриконом 30 кДа и нанесён на колонку заполненную катионообменой смолой Resource S (GE Healthcare). Элюцию осуществляли линейным градиентом раствора NaCl. Далее элюат был дочищен методом быстрой жидкостной хроматографии (FPLC) на обращено-фазовом сорбенте Resource RPC. На выходе было получено 3 мг с литра культуральной среды. Таким образом, общий выход стадии очистки составил 15%.
.2 Получение rhVEGF165 в прокариотической системе экспрессии
Биологическая активность VEGF165 не зависит от гликозилирования Asn 75 (D. Peretz et al., 1992) поэтому, стало возможным, использование прокариотической системы экспрессии для получения терапевтически активных форм.
Бактериальная система экспрессии легко масштабируема и даёт возможность получить VEGF менее дорогостоящим способом в более короткие сроки (F. Baneyx, 1999; Graumann and Premstaller, 2006; Swartz, 2001). В литературе были описаны способы получения растворимых форм VEGF165 и VEGF121 виде гибридного белка (Arora, 1999; Kim, 2007). Литературе имеются многочисленные публикации по получению VEGF165 в составе теле включений (Scrofani et al., 2000; Morera et al., 2006).
В статье (Shelly A. Pizarro et al., 2010) авторами описан способ получения рекомбинантного VEGF 165 в бактериальной системе экспрессии выход, которого составил 9 г с литра биомассы, что на мой взгляд вызывает сомнение. Представлена стратегия очистки, включающая три шага хроматографирования. Ферментация биомассы осуществлялась в режиме фед-бетч, за счёт чего достигалась так называемая высокая клеточная плотность. Синтезированый белок образовывал тельца включения, поэтому после дезинтеграции бактериальных клеток было необходимо осуществить экстракцию белка из телец включения с последующим рефолдингом. Хроматорафическая стадия включала последовательное использование хроматографии смешанного режима на сорбенте CaptoтДв MMC, далее применяли катионообменную смолу SP Sepharose HP и окончательную доочистку целевого белка осуществляли на гидрофобном сорбенте PhenylSepharoseтДв 6 FastFlow. Общий выход после стадий экстракции, ренатурации и хроматографии составил около 30%.Liang Lee с соавторами описали методику экспрессии и очистки рекомбинантного VEGF 165 в бактериальных клетках E. сoli Tuner (DE3) pLacI (Novagen, Madison, WI) (I-Liang Lee et al., 2010). В качестве экспрессионного вектора авторами была использована pET-1. Целевой белок экспрессировался в виде телец включения. Поэтому, также как и в ранее описанной статье, перед авторами стояла задача солюбилизировать тельца и осуществить ренатурацию экстрагированного белок. Экстракцию белка из телец включения осуществляли буферным раствором содержащий 4 М мочевину. Полученный экстракт телец включения содержал денатурированную мономерную форму rhVEGF165. Ренантурацию белка осуществляли поэтапным разведением экстракта раствором 1 М L-аргенина содержащем небольшое количество окисленного глутатиона. После чего ренатурационную смесь разделяли на катионообменом сорбенте Mono S. Выход белка после описанной стадии составил 1 мг на литр бактериальной культуры.
рекомбинантный васкулярный эндотелиальный рост
4. Материалы
Реактивы
В работе использованы трис, акриламид, N,N-метилен(бис)акриламид, персульфат аммония (Sigma), ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агар (Difco), дрожжевой экстракт (Sigma), ИПТГ (Sigma), бакто-триптон (Difco).
Т4-ДНК-лигаза (Fermentas, #EL0014), Т4-полинуклеотидкиназа (Fermentas, #EK0031), Taq ДНК-полимераза (Fermentas), эндонуклеазы рестрикции Nco I, Xho I, Xba I, Bam HI, Bgl II, Hind III, Eco RI.