Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
? образуются два ранее описанных домена: амино-терминальный рецептор связывающий домен (1-110 аминокислотных остатка) и С-концевой гепарин связывающий домен (C. Wiesmann et al., 1997; R.G. Keck et al., 1997).
Понимание биологических свойств сосудистого эндотелиального фактора роста и механизма рецептор опосредованного ангиогенеза открыли широкие возможности терапевтического применения VEGF, а также создание стратегий борьбы с онкологическими заболеваниями.
.4 Биологическая роль VEGF165
Васкулярный эндотелиальный фактор роста VEGF в особенности VEGF165 стимулирует ангигиогенез и сосудистую проницаемость (Senger et al., 1983; Keck et al., 1989). За счёт лиганд-рецепторного взаимодействия происходит гомо или гетеро димеризация рецепторов VEGFR1 (также известного как Flk-1)и VEGFR2 (также известного как Flk-1или KDR), которая приводит к автофосфорилированию некоторых тирозиновых аминокислотных остатков цитоплазматического домена. Вдобавок VEGF рецепторы образуют гетеродимеры с семафориновыми рецепторами неофилина (NRP) 1 и 2. NRP рецепторы усиливают, но напрямую не участвуют в VEGF опосредованной сигнализации. Основным рецептором VEGF является VEGFR2, димеризация которого активирует целый ряд внутриклеточных каскадов таких как активация MAPK, фосфатидил-инозитол 3 киназы (Pl3-K), протеин киназы С (PKC), AKTи PLC путей ведущие к усилению пролиферации, миграции, MMP экспрессии, выживаемости и проницаемости эндотелиальных клеток. VEGFR1 выполняет вспомогательную функцию и не участвует в запуски сигнальных каскадов из за низкого уровня автофосфорилирования.
Рис. 5. Инициация VEGF каскада внутриклеточных сигналов (Bonnie, 2009)
Биологическая важность VEGF была продемонстрирована на модельных трансгенных мышах. Исследования показали, что удаление одного из аллелей ген Vegf или аллеля гена рецептора VEGFR-1 (Flt-1) или VEGFR-2 (KDR/Flk-1) приводит к эмбриональной летальности в следствии серьёзных нарушений в развитии сосудов (Fongetal., 1995; Shalabyetal., 1995; Carmelietetal., 1996; Ferraraetal., 1996). Тогда как сверхэкспрессия VEGF приводит к эмбриональной смертности от E12.5-14 в результате дезорганизации кровеносных сосудов, порока сердца и дефектов каронарных сосудов (Miquerol et al., 2000).
Помимо действия на эндотелиальные клетки, VEGF оказывает влияние и на другие типы клеток в зависимости от наличия VEGFR2 и VEGFR1 рецепторов. В почках гломерулогенез и функционирование почечного гломерулярного фильтра находятся под строгим (ген-зависимым) контролем VEGF (Ellen C. Breen, 2007). Последний также участвует в регенерации мышечных клеток, ремоделировании миокарда и эндохондральном костеобразовании, он действует как хемоаттрактант, мобилизующий эндотелиальные клетки костного мозга (Street and Lenehan 2009). На сегодняшний день, описано влияние VEGF на моноциты (Barleon et al., 1996; Clauss et al., 1996), макрофаги (Duyndam et al., 2002), тучные клетки (Norrby, 2002), эозинофилы (Feistritzer et al., 2004), дендритные клетки (Dikov et al., 2005), мегакариоциты (Casella et al., 2003), лимфоциты (Farahani et al., 2005), альвиолярные эпителиальные клетки второго типа (Compernolle V et al 2002) и эпителий хрусталика (Shui YB et al., 2003), гомопоэтические стволовые клетки производные косного мозга циркулирующие в кровотоке (Gerber et al., 2004; Grunewald et al., 2006; Murayama et al., 2002; Iwaguro et al., 2002). VEGFспособствует: выживанию гемопоэтических стволовых клеток, нервных клеток и лимфоцитов, дифференцировке мегакариоцитов и дендритных клеток и участвует в мобилизации клеток предшественников костного мозга. Результаты тромбоцитопении и нейтропении демонстрируют участие VEGFв регуляции уровня пролиферации тромбоцитов и лейкоцитов. VEGF также участвует в лимфоангиогенезе. Помимо его биологического действия на эндотелиальные клетки и клетки иммунной системы появляются новые сведения о его роли в росте и выживаемости нейронов. В статье (Schanzer et al., 2004) было показано, что VEGF действует на стволовые клетки нейронов in vitro и in vivo. В синоптических окончаниях и глиальных клеток экспрессируется рецептор VEGF. Патологически низкий уровень экспрессии VEGF связан с дегенерацией мотонейрона (Oosthuyse et al., 2001).
2. ПРИМЕНЕНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА VEGF165 В МЕДИЦИНЕ
.1 Терапевтический ангиогенез
В регуляции ангиогенеза участвует большое количество ростовых факторов. Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000).
Ангиогенез - сложный процесс, осуществляемый путем строго скоординированной во времени и пространстве работы многих факторов. В экспериментальных работах совместное использование VEGF и фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) в сочетании с FGF-2 индуцирует образование сосудистой сети, которая остается стабильной даже через 1 год после прекращения действия этих факторов (ShyuK-G et al 2003; Cao R et al 2003). Еще одним подходом к более сбалансированной стимуляции ангиогенеза может быть создание генетических конструкций на основе гибрида геномной ДНК и кДНК форм гена VEGF, которые содержат экзоны и интроны в различно сплайсирующейся области, что обеспечивает экспрессию нескольких изоформ VEGF, как это естественно происходит в тканях (Whitlock PR et al., 2004).
Возможность неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью VEGF и FGF доказана в многочисленных экспериментальных работах с помощью гистологических, ангиографических, радионуклидных методов на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц у грызунов (мыши, крысы, кролики), собак, свиней и овец (Парфенова и Ткачу