Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
>
Плазмидный вектор
pET32b(+) (Novagen)
pTWIN1 (New England Biolabs)
Бактериальные штаммы
E.coli ER2566 ( [F- lamda- fhuA2 [lon] ompT lacZ:: T7 gene1 gal sulA11 D(mcrC- mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-- TetS)2 R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1 [dcm]). coli Origami (DE3) ?(ara-leu)7697 ?lacX74 ?phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F[lac+lacI pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (KanR, StrR, TetR)4
В работе использовались настольные центрифуги Z 383K(Hermile) и Centrifuge 5430R (Eppendorf), (Heraeus); амплификатор (PTC-0200 DNA Engine Cycler) (Bio-Rad); сухой термостат DVE (Heraeus); качалку с термостатируемой камерой Certomat (ETH); источники постоянного тока: 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB), 2301 Macrodrive-l (LKB), 2301 Macrodrive-5 (LKB), Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia); ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius); Спектрофотометр SmartSpec Plus (Bio-Rad, США); ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.); УФ-трансиллюминатор (Desaga); весы аналитические (Mettler PM460); автоматические микропипетки (Gilson, Eppendorf).
Питательные среды
LB: 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7.3
YT-бульон: 0,8 % бакто-триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 0,5 % NaCl.
SOB: 2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,01 М NaCl, 0,01 М KCl, 0,01 М MgCl2, 0,01 М MgSO4, pH 7,5
Буферные растворы
50ТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе):
М трис-ацетат, рН 8,0, 1 М Na-ацетат, 0,9 М NaCl, 50 мМ ЭДТА.
Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:
Буфер для приготовления образцов - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% SDS, 20% глицерин, 3% 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий;
Стоковый раствор 40% акриламид/1,3% N,N-метилен-бисакриламид в воде.
LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,1%SDS;
UTB (буфер для концентрирующего геля) 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS.
ЧБуфер для Taq-полимеразы: 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % TWEEN-20, 1,5 мМ MgCl2.
Ч Буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 25 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 0,4 мМ рАТР.
ЧБуфер для полинуклеотидкиназы фага Т4: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ.
X Buffer TangoтДв (Fermentas): 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9 при 37C), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1мг/мл БСА.
ЧБуфер для эндонуклеаз рестрикции Green (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37C), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.
ЧБуфер для эндонуклеаз рестрикции Orange (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37C), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.
5. Методы
Создание штамма продуцента ER2566/pTTS-VEGF165
К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET32b+ добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango yellow (Fermentas), 4 мкл дистилированой воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Eco RI и Hind III. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента pET32b+ добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотидного дуплекса TRX_STOP, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4 и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы фага Т4 (Fermentas). Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов.
Ген Trx-stop-start амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 50 мкл реакционной смеси, содержалось 10 нг матрицы из ранее полученной лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10 буфера для Taq-ДНК-полимеразы, SdNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе по следующей программе:
) денатурация 40 сек. при 93С, отжиг 40 сек. при 58С, элонгация 30 сек. при 72С (5 циклов);
) денатурация 30 сек. при 93С, отжиг 30 сек. при 60С, элонгация 30 сек. при 72С (24 цикла).
Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно протоколу фирмы-производителя.
К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTWIN1 (New England Biolabs) добавили 4 мкл 10Чбуфера Orange, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции XbaI и BamHI. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл очищенного экстракта, содержащего линеаризованный фрагмент pTWIN1 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотида TTS и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течение 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и рассеивали их на твёрдой питательной среде. Из выросших колоний выделяли плазмиду набором QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Xba I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37оС. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0.5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг ранее амплифицированного Trx-stop-start, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течение 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-Trx. К 10 мл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS-Trx добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Sap I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS Trx добавили