Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
нкированного Xho I и Bgl II сайтами рестрикции добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Bgl II. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы Евроген согласно протоколу производителя. К 15 мкл экстракта, содержащего 0,2 мкг линеаризованного фрагмента плазмиды pET-CBD и 0.5 мкг амплифицированного гена hVEGF165 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. Из отобранных клонов выделяли плазмидную ДНК набором фирмы QIAGEN. В результате получили экспрессионную плазмиду pCBD-VEGF 165, в качестве штамма носителя использовали E. coli Origami (DE3).
Культивирование штамма Origami (DE3)/pCBD-VEGF165
Плазмидой pCBD-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37 оС на шейкере при 200об/мин в течение 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в 250 мл питательной среды SOB, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 37оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100мкг/мкл. Инкубировали в течение 16 часов при 30о С.
Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF165
Биомассу штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 2 М мочевины, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 107 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Осветлённый лизат объёмом 15 мл разбавили раствором 2 М мочевины до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, 2 М мочевины, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом SDS-электрофорезом. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 19,31 мг.
Концентрирование ГБ метом ультрафильтрации
Объединённые фракции трёх с трёх разрушений объёмом 81 мл разбавили буфером (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5) в 3,5 раза до 300 мл (концентрация белка 0,19 мг/мл) и концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 15 раз. В результате получили 20 мл раствора с концентрацией ГБ 2,2 мг/мл.
Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой.
К концентрату добавили экстракт телец TEV до соотношения фермент-субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37oС. Реакционную смесь нанесли на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) и хроматографироговали по ранее описанной методике. Фракции, содержащие целевой белок были объединены и сконцентрированы.
Высокоэффективная жидкостная хроматография на колонке Диасорб С18
Очистку осуществляли на колонке Диасорб-130 -С16Т 7 мкм, 16Ч250 мм в градиенте концентрации 30%-50% ацетонитрила с 0,1% ТФУ при скорости потока 5 мл/мин в течение 35 мин. Фракции, содержащие чистотой более 98%, объединяли и лиофилизировали. Итоговый белок - 11,5 мг.
6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПААГ
Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (система Laemmli.).В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор Kalibration kit": молекулярный вес - 14.4, 20.1, 30.0, 43.0, 67.0, 94.0 кДа (Pharmacia).
Использовали двухступенчатый гель: верхний (концентрирующий) - 3,5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) - 15% ПААГ в буфере LTB с инициатором полимеризации персульфата аммония (1/100 объема геля) катализатором полимеризации и TEMED (1/1000 объема). Размер и толщина геля определялся размерами стёкл, толщиной спейсеров и составлял 9х12х0,05 см.
Электрофорез проводили в 1х трис-глициновом буфере с SDS при постоянном силе тока в 22 мА. Электрофорез прекращали, когда фронт красителя бромфенолового синего не выходил в буфер. Затем гель помещали на 15 минут в фиксирующий раствор (10% ТХУ, 10% метанол), потом - на 15 минут в красящий раствор (0,2% Кумаси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола) при 60СФС. Краску геля отмывали кипячением в 5%-ом растворе уксусной кислоты.
Определение концентрации белка методом Бредфорд
Реактив Бредфорд готовили следующим образом: кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95% - ного EtOH. К полуяеному раствору добавили 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и водой довили объём смеси до 1л.
К анализируемому образцу, содержащему белок в диапазоне 0,5 -9 мг/мл добавили 2,5 мл реагента-красителя и хорошо перемешали. Измеряли поглощение при длине волны 595 нм относительно чистого реагента.
Концентрацию белка находили по градуировочному графику построенному по БСА.
Результаты и обсуждение
В ходе выполнения курсовой работы на тему Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста нами был осуществлён химико-ферментативный синтез из перекрывающихся олигонуклеотидов гена человеческого VEGF165. Ген hVEGF165 был оптимизирован по встречаемости кодонов для экспрессии в E. coli. Он был клонирован в экспрессионный вектор pET-23d(+) и получен штамм продуцент E. coli ER2566/ pER-VEGF165. Однако, продукция целевого белка hVEGF165 в клетках E. coli ER25