Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
В¶ащийся в осветлённом лизате, очищали от белков E. coli на колонке HiTrap HP Heparin-Sepharose. Полученные фракции анализировали на наличие димера гибридного белка с помощью SDS-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих условиях.
Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A - димер гибридного белка CBD-hVEGF165. B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165.
По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.
Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 iелью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.
Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF165 TEV протеазой.
Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37оС на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.
Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мм.
Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF165, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C - hVEGF 165.
Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37оС и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).
Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A - димер hVEGF165, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C - мономер hVEGF165.
Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).
Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF165
hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF165 был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.
Таблица 3
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF165.
Этапы очисткиОбщий белок (мг)Содержание ГБ (%)Содержание hVEGF165 (%)Осветлённый клеточный лизат42815Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose77,290Концентрирование на мембране YM 305690Расщепление ГБ TEV протеазой5676Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose3490ОФ ВЭЖХ22,497
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами было создано несколько генетических конструкций для бактериальной системы экспресии человеческого васкулярного эндотелиального фактора роста hVEGF165 (pTrx-stop-hVEGF165, pTrx-hVEGF165, pCBD-hVEGF165). Отобрана наиболее эффективная из них и подобран оптимально подходящий штамм E. coli. для гетерологической экспрессии данного ростового фактора. Отработана методика и схема выделения целевого белка.
ВЫВОДЫ
.Получен высокопродуктивный штамм продуцент hVEGF165 E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF165.
2.Определены оптимальные условия культивирования.
.Разработана схема выделения и очистки hVEGF165.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Базин И., Гарин А. Таргентные антиангиогенные препараты в терапии солидных опухолей. Врач 2008, 11: 52-55.
2.Кузьмин А.Г., Липатов Д.В., Смирнова О.М., Шестакова М.В. Анти-VEGF препараты для лечения диабетической ретинопатии. Офтальмохирургия. 2009, 3: 15-19.
.Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Вопр. мед. хим. 2000, 46: 293-310.
4.Arora N., Masood R., Zheng T., J. Cai, D.L. Smith, P.S. Gill. Vascular endothelial growth factor chimeric toxin is highly active against endothelial cells. Cancer Res. 1999, 59: 183-188.
.Baneyx F., Recombinant protein expression in Escherichia coli, Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10: 411-421
.Barleon B, Sozzani S, Zhou D, Weich H A, Mantovani A, Marme D. Migration of human monocytesin response vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood. 1996, 87: 3336-3343.
.Bonnie J. Nieves, Patricia A. DAmore, and Brad A. Bryan. The function of vascular endothelial growth factor International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Inc.Volume 2007 35, 332-337
8.Cantell, K. The Story of Interferon, 1998.
.Cao R, Brakenhielm E, Pawliuk R. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF. NatMed. 2003, 9: 604-13.
10.Casella I, Feccia T, Chelucci C, Samoggia P, Castelli G, Guerriero R, Parolini I, Petrucci E, Pelosi E, Morsilli O, Gabbianelli M, Testa U, Peschle C. Autocrine-paracrine VEGF loops potentiate the maturation of megakaryocytic precursors through Flt1 receptor. Blood. 2003, 101(4):1316-23.
11.Christensen J.G. A preclinical review of sunitinib, a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor with anti-angiogenic and antitumour activities. Annals of oncology. 2007, 18 1375-1381.
.Clauss M., Weich H., Breier G., Knies U., Rockl W., Waltenberger J, Risau W. The vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 mediates biological activities. Implications for a functional role of placenta growth factor in monocyte activation and chemotaxis. J BiolChem. 1996; 271(30): 17629-17634.
.Compernolle V., Brusselmans K., Acker T., Hoet P., Tjwa M., Beck H, Plaisance S, Dor Y, Keshet E, Lupu F, Nemery B, Dewerchin M, Van Veldhoven P, Plate K., Moons L., Collen D., Carmeliet P. Loss of HIF-2alpha and inhibition of VEGF impair fetal lung maturation, whereas treatment with VEGF prevents fatal respiratory distress in premature mice. Nat Med. 2002, 8(7): 702-10.
.Dikov M.M., Ohm J.E., Ray N, Tchekneva E.E., Burlison J., Moghanaki D., Nadaf S. Carbone D.P. Differential roles