Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Разработка и совершенствование биотехнологических процессов при промышленном производстве биопрепаратов

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

 

Оборудование для фильтрования и разделения. Для тонкого и стерилизующего фильтрования водных растворов, биологических жидкостей, питательных сред, ферментных растворова с помощью мембранных фильтров использовали фильтродержатели диаметром 90, 142, 293 мм и мультиплетную установку УСФ-0,28/7. Мембранное разделение различных растворов осуществляли на фильтрационных ячейках ФМ-02 объемом 10, 200, 1000 мл с магнитной мешалкой, тонкоканальной установке ФТ-01, опытной ультрафильтрационной установке Уфильтр-прессФ УФ-5, иа ультрафильтрационных разделительных модулях на полых волокнах фирмы Мем-Текс (РФ г. Мытищи): аУВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА и модифицированной установке УФУ с центробежным насосом марки ЦНГ-0,5/10. Электродиализатор типа ЭК-04-74 с ионообменными мембранами (катионитовыми МК-40 и анионитовыми МА-41) использовали при обессоливании альбумина в производственных условиях. При электродиализе происходит перенос ионов из одного раствора в другой через ионообменные мембраны. Движущей силой процесса является внешнее электрическое поле. Катионы двигаются к катоду, а анионы к аноду. Постоянный ток, проходящий через раствор, устанавливается в зависимости от природы растворенных веществ, их концентрации и подведенного напряжения.

Для разделения культуральных жидкостей, выделения клеток, вирусов, ферментов, сбора осадка, белка из надосадочной жидкости, осветления суспензийа применяли различные центрифуги и сепараторы: S-23, S-24, S-70; ОФСст- 0,1; ОФСст- 0,2; ОТР-101К; сепаратор Ж5-АСГ-3М (Гуславский А.И.).

2.1.3. Методы

Методы культивирования клеток и вирусов. Пролиферативную активность клеточных культур оценивали с помощью индекса пролиферации. Концентрацию клеток определяли путем их подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток в суспензии выражали в процентом соотношении к общему количеству клеток. Титр вируса ВГИ определяли по количеству фокусообразующих единица в 1 см3, титр вируса ИББ по методу Кербера (1931) в модификации Ашмарина И.П. (1959).

Методы контроля фермента. Физико-химические свойства трипсина определяли по ГОСТ 202642-89. Наличие фермента в суспензии осуществляли экспресс-методом на фотопленке; протеолитическую активность - по РСТ ЛССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500 и ТУ 9358.013.00008064-96 - по Шоу-Петиколас. Диспергирующие свойства трипсина на тест-культуре клеток ФЭК оценивали по выходу клеток из 1 г, жизнеспособности, адгезивным и ростовым свойствам (урожаю, УК и индексу пролиферации, ИП).

Физико-механические свойства полимерных композиций. Свойства полимерных вулканизатов в исходном состоянии и после теплового старения определяли по ГОСТ 9024-74 и ГОСТ 9.029-74.

Статистическая обработка результатов. Приа статистической обработке экспериментальных результатов использовали метод регрессивного анализа. Достоверность результатов оценивали по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1980). Результаты считали достоверными при Р < 0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Производство биопрепаратов представляет собой комплекс взаимосвязанных биотехнологических процессов: приготовление компонентов среды и ее изготовление, получение фермента и его раствора для дезагрегации культур тканей; культивирование (клеток, вирусов и бактерий); выделение и очистка биологических растворов, питательных сред и растворов; сушка биопрепаратов. В связи с этим рассматривались вопросы получения отечественного ферментного препарата трипсина для вирусологических целей, процессы культивирования клеток при получении вирусных вакцин, осуществления крупномасштабного культивирования в стерильных условиях; получения бактерийной массы для получения протеина А, разработки мембранных способов очистки, разделения, концентрирования и стерилизации при использовании отечественного оборудования и материалов.

2.2.1. Усовершенствование технологии получения

фермента трипсина

2.2.1. 1. Разработка технологических процессов изготовления трипсина

В производстве противовирусных вакцин для дезинтеграции клеток используется протеолитический фермент трипсин, в основном импортного производства. Нами проведены исследования по разработке технологии получения фермента отечественного производства. Для этого необходимо было решить комплекс задач, таких как выделение, разделение и очистка фермента, его консервация, оценка физико-химических и биологических свойств. В качестве исходного сырья при получении фермента использовали поджелудочную железуа (ПЖ) крупного рогатого скота (КРС), свиньи и птиц. ПЖ КРС была наиболее технологична. Исходноеа сырье использовали после 4-12 месяцев хранения, обеспечивающее активацию проферментаа трипсина. Двукратное замораживание, оттаивание и последующее измельчение ПЖ до частиц размером 8 мм, разрушающие клеточные оболочки ткани, исключалиа образование устойчивой суспензии и способствовали полному выделению фермента из исходного сырья иа увеличениюа активности препаратаа на 40 ЕД (22-27%) по сравнению с сильно измельченной железой ( до частиц 2 мм). Максимальную активность фермента получали через 6 час экстрагирования и 12 час отстоя на первой стадии и в течение 2-3 час экстрагирования на второй стадии. Перемешивание суспензии в процессе экстрагирования проводили в автоматическом режиме (3 мин - перемешивание, 7 мин - простой), обеспечивающее незначительное пенообразование и исключающее получение устойчивой суспензии. Экстрагирование фермента проводили при температуре не выше 16оС, так как при более высокой температуре наблюдается инактивация и самопереваривание трипсина. Снижение температуры суспензии до 7+2 оС позволило получить препарат с максимально высокой активностью. РН на 1 этапе экстрагирования составлялаа 3,1 - 3,35, аа наа 2 этапе - 1,7 - 2,0. При осаждении балластных веществ ва течение 6 час выход составил 9,5% от объединенного экстракта и 30% от исходного сырья. Выход балластных веществ в сухом виде составил 11% от его общей массы иа 2,3% от исходного сырья. После 12-18 час второго этапа высаливания выход трипсина по отношению к фильтрату после удаления балластных веществ составил 2-2,5%.а Процент выхода трипсина от исходного сырья колебался ота 2,5% до 6%. В сухом видеа выход фермента составил 60-80% от осажденного субстрата и 2,5-3,5% ота массы исходного сырья.

Проведенные исследования позволили рекомендовать для разделения суспензии после экстрагирования следующее оборудование с учетом массы исходного сырья: до 70 кг - центрифуги ОФСст; от 70 до 100 кг - центрифуги Рапид, ОФСст, от 100 и более - шнековую центрифугу ОГШ отдельно или совместно с центрифугой ОФСст для последующего осветленияа фильтрата. При разделении суспензии после высаливания балластных веществ и трипсина использовали следующее оборудование: 20-50 кг - центрифугу ОФСст, 20-100 кг -а суперцентрифугу ОТР-101К, более 100 кг - сепараторы для отделения балластных веществ и трипсина, и суперцентрифугу для извлечения трипсина после осаждения. Протеолитическая активность препарата после разделения суспензии с помощьюа центрифуг была на 20-40% выше, чем при использовании обычного фильтрования, при этом снизились потери, и улучшилось качество готового препарата. Кроме того, в 2-3 раза уменьшились затраты рабочего времени и количество обслуживающего персонала.

Остаточное содержание солей в высоле трипсина составляло 30-50%, удаление которых проводили с помощью ультрафильтрационных установок на полых полупроницаемых волокнах из полиамида при диафильтрации, что позволило в 6-7 раз снизить количество асульфата аммония до 3-5 %, при необходимости до полного обессоливания.

В связи с термолабильностью ферментного препаратаа изучали возможные способы его консервации при использовании различных методов высушивания и влияние их на ферментативную активность трипсина (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная оценка влияния методов высушивания на

ферментативную активность трипсина

n=3

Метод высушивания	Температура высушивания,а 0С		Время сушки, ч	аа Характеристика препарата
	на входе	на выходе		Массовая доля влаги,%	Активность, ЕД
Распылительный	130-140	60-75	2	1,56+0,37	443+28,6
Сублимационный	-40	30	30	2,30+0,24	455+9,0
Кондуктивный (калориферный)	35-37		24-30	4,25+1,11	232+17,6
Конвективный	35-37		24-30	3,85+0,82	294+25,0
Нативный препарат, контроль	-	-	-	50,00+3,24	492+26,2

Результаты проведенных исследований по выбору метода высушивания конечного продукта показали, что кондуктивный и конвективный методы длительны и требуют дополнительных технологических операций измельчения и просеивания трипсина, кроме того кондуктивный метод повышает вероятность обсеменения фермента. Наиболее эффективным по производительности и экономичности для больших объемов является метод распылительного высушивания, позволяющий получить тонкодисперсный порошок трипсина, содержащий не более 3% массовой доли влаги, с активностью близкой к нативной форме трипсина, альтернативным для небольших партий - сублимационный метод. Преимуществом этих двух способов является получение трипсина с высокой протеолитической активностью, низкой массовой долей влаги, не требующих измельчения и просеивания ферментного препарата. Полученный трипсин соответствовал требованиям ТУ9358-013-00008064-96: протеолитическая активность не ниже 150 ЕД по Шоу-Петиколас; массовая доля влаги не более 3 %, значение буфера - 7,4 при растворении образца фермента; значение мутности не фильтрованного раствора не более 6,5х10-3 1/см или не более 0,05 ЕД оптической плотности (ОП); выход клеток из 1 г ткани КЭ в пределах 150-215 млн клеток при 90-96% жизнеспособности. Серия трипсина для получения культур клеток считают активной и нетоксичной, если изготовленный из него 0,25% раствор обеспечивает дезагрегацию и выход из 1 г ткани не менее 90 млн. клеток с жизнеспособностью не ниже 90%, без признаков дегенерации клеток в культуре.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии