Патоморфологический анализ острого геморрагического панкреонекроза и его коррекция в эксперименте и клинике 14. 03. 02 патологическая анатомия 14. 01. 17 хирургия
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Рабочая программа учебной дисциплины патологическая анатомия, клиническая патологическая, 480.03kb.
- Общая патологическая анатомия, 283.39kb.
- Компьютерный анализ антибактериальных систем нейтрофильных лейкоцитов в оценке характера, 230.73kb.
- Патологическая анатомия и дифференциальная диагностика рака большого сосочка двенадцатиперстной, 388.21kb.
- Примерная программа наименование дисциплины Патологическая анатомия, клиническая патологическая, 594.5kb.
- Примерная программа по дисциплине патологическая анатомия для аттестации на категорию., 363.01kb.
- Ф-программа вступительного экзамена в аспирантуру Утверждаю, 254.47kb.
- Динамика показателей гомеостаза и их коррекция при деструктивных формах острого аппендицита, 421.23kb.
- Патологическая анатомия это медико-биологическая наука, изучающая структурные и морфологические, 1590.52kb.
- Стимуляция заживления и профилактика гнойных осложнений послеоперационных ран передней, 683.25kb.
На правах рукописи
Асатрян Аршак Арутюнович
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ОСТРОГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО
ПАНКРЕОНЕКРОЗА И ЕГО КОРРЕКЦИЯ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И КЛИНИКЕ
14.03.02 – патологическая анатомия
14.01.17 – хирургия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Новосибирск – 2011
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)
^ Научные руководители:
доктор медицинских наук Бакарев Максим Александрович
доктор медицинских наук Проценко Светлана Ивановна
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук,
профессор ^ Любарский Михаил Семенович
доктор медицинских наук,
профессор Криницына Юлия Михайловна
Ведущая организация:
ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина Минздравсоцразвития РФ
Защита диссертации состоится «_____» ______________ 2011 г. в ___ час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2).
Автореферат диссертации разослан « ______ » _____________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 001.037.01
доктор биологических наук,
профессор Молодых Ольга Павловна
^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В структуре ургентных хирургических заболеваний острый панкреатит занимает 3-е место после аппендицита и холецистита (Кузнецов Н.А. и др., 2003; Jha R.K. et al., 2009). Среди деструктивных форм, которые составляют 5,2 – 30% от числа больных острым панкреатитом и определяют высокую летальность (от 35 до 80%), особое место занимает геморрагический панкреонекроз, отличающийся молниеносным течением, выраженной токсемией и тяжелыми гемодинамическими нарушениями (Савельев В.С. и др., 2008; Винник Ю.С. и др., 2009; Проценко С.И. и др., 2010). Такие показатели указывают на недостаточную эффективность предлагаемых методов лечения.
Залогом адекватной патогенетической терапии является понимание триггеров, инициирующих патологический процесс у человека. Принято считать, что ведущую роль в генезе повреждения поджелудочной железы играют процессы ферментного аутолиза в сочетании с сосудистыми поражениями (Вискунов В.Г., 1995; Маев И.В., Кучерявый Ю.А., 2008). Тем не менее, многие детали последовательности биохимических и структурных реакций до сих пор не известны (Frossard J.L., Pastor C.M., 2002), что во многом связано с отсутствием хорошо воспроизводимых моделей панкреонекроза (Su K.H. et al., 2006).
Экспериментальное моделирование острого панкреатита достигается разнообразными методами. Большинство из них в той или иной степени воспроизводят механизмы, связанные с повышением давления в протоковой системе поджелудочной железы, и характеризуются относительно «мягким» течением патологического процесса без полиорганных повреждений, характерных для деструктивных форм заболевания (Chan Y.C., Leung P.S., 2007). «Трипсиновая» модель имеет существенные отличия (Вискунов В.Г., 2000; Odaira C. et al., 1986) – наряду с активацией трипсиногена и других проферментов трипсин способен индуцировать пусковые реакции в протеолитических каскадных системах крови (Локшина Л.А., 1994); его введение в ткань поджелудочной железы приводит к выраженным нарушениям микроциркуляции, обусловливает развитие геморрагического панкреонекроза, гемодинамического шока, ДВС-синдрома и полиорганной недостаточности (Проценко С.И. и др., 2011; Sakaguchi Y. et al., 2006).
Подобные процессы, в частности, протеолитическую атаку трипсиноподобными протеиназами, геморрагическое повреждение, ДВС-синдром, вызывает и змеиный яд гадюки обыкновенной (Marsh N.A., 1994; Matsui T. et al., 2000). Кроме протеиназ, в нем содержатся цитотоксины, группы белков, обладающих свертывающим, антисвертывающим и геморрагическим действием (Markland F.S., 1998), а также фосфолипаза А2, способная вызывать повреждение мембран, в том числе и в клетках поджелудочной железы (Gasanov S.E. et al., 1997; Mossner J. et al., 2000).
Сходные биологические эффекты яда гадюки и трипсина стали основанием для использования змеиного яда в качестве инициирующего фактора при создании новой модели острого панкреатита и проведения на ее основе оценки эффективности одного из методов коррекции – блокады панкреатической секреции при помощи сандостатина (соматостатина) (Гельфанд Б.Р. и др., 1998). Среди механизмов его положительного действия определенную роль могут играть и другие эффекты, в частности, снижение уровня воспалительно-ассоциированных цитокинов, улучшение реологических свойств крови (Брискин Б.С. и др., 2001; Jambrik Z. et al., 2002; Wu H. et al., 2003; Wu J.X. et al., 2004).
Сандостатин эмпирически используется для профилактики и лечения острого панкреатита, однако отсутствие четких представлений о его влиянии на характер морфологических изменений в поджелудочной железе в динамике патологического процесса и противоречивые данные клинических исследований (Толстой А.Л., 2001; McKay C.J. et al., 1993; Heinrich S. et al., 2006) сдерживают более широкое применение препарата. Другим немаловажным фактором является его высокая цена.
В поиске новых средств патогенетической терапии, учитывая сходство основных аспектов действия секрета поджелудочной железы и яда гадюки, мы предположили, что терапевтическая эффективность антисыворотки к змеиному яду может выходить за рамки ее прямого назначения при укусах змей. Действующими факторами антисыворотки являются антитела к белковым компонентам яда, она практически полностью устраняет его фосфолипазную активность (Anai K. et al., 2002). Поскольку фосфолипазе отводится существенная роль в формировании острого панкреатита различной природы (Hietaranta A.J. et al., 1995; Tcholakov O. et al., 1999), представляется обоснованным исследовать действие антисыворотки к змеиному яду в экспериментальной терапии.
^ Цель исследования: изучить патоморфогенез экспериментального геморрагического панкреонекроза, индуцированного змеиным ядом, и разработать способы его коррекции, а также изучить влияние сандостатина на характер морфологических изменений в поджелудочной железе в динамике патологического процесса для разработки тактики лечения панкреонекрозов.
^ Задачи исследования:
1. Разработать модель геморрагического панкреонекроза путем введения змеиного яда в ткань поджелудочной железы и провести комплексное патоморфологическое (светооптическое и электронно-микроскопическое) исследование поджелудочной железы и органов брюшной полости в сравнении с трипсиновой моделью панкреонекроза.
2. На основании патоморфологического анализа поджелудочной железы и органов брюшной полости после введения змеиного яда в клетчатку забрюшинного пространства оценить роль поджелудочной железы как источника аутоферментной агрессии при развитии экспериментального патологического процесса.
3. По данным патоморфологического исследования поджелудочной железы и органов брюшной полости оценить эффективность профилактического и лечебного применения сандостатина на различных стадиях острого экспериментального панкреатита, индуцированного введением змеиного яда.
4. На основании патоморфологического анализа изменений органов брюшной полости изучить эффект лечебного применения сандостатина при отечно-некротическом процессе в тканях боковой стенки живота с оценкой роли механизмов положительного действия препарата, не связанных с подавлением панкреатической секреции.
5. Провести сравнительную патоморфологическую оценку эффективности раннего применения антисыворотки к змеиному яду при остром экспериментальном панкреатите, индуцированном змеиным ядом и трипсином.
6. На основании экспериментальных исследований, а также сравнительного анализа результатов лечения больных острым панкреатитом обосновать оптимальную тактику лечения при геморрагических формах острого панкреатита.
^ Научная новизна. Разработана новая модель острого панкреатита – введение змеиного яда в ткань поджелудочной железы. Впервые по данным сравнительного патоморфологического исследования обнаружено принципиальное сходство эффектов яда гадюки обыкновенной и трипсина на систему гемостаза, а также на характер и динамику повреждения поджелудочной железы и ряда висцеральных органов.
Впервые описан морфогенез индуцированного змеиным ядом экспериментального патологического процесса в поджелудочной железе. Показано, что, как и в трипсиновой модели, введение яда гадюки обыкновенной вызывает быстро прогрессирующий панкреонекроз, который по своим патоморфологическим характеристикам (выраженная экссудация междольковой стромы, массивные плазмо- и геморрагии, очаги аутолиза ацинарных клеток, распространение деструктивных изменений от периферии к центру) соответствует наиболее тяжелым формам геморрагического панкреонекроза и обусловливает развитие панкреатогенной токсической недостаточности внутренних органов и гибель абсолютного большинства животных в течение суток.
При трехчасовом наблюдении за динамикой макроскопических изменений органов брюшной полости, а также на основании анализа светооптических и ультраструктурных особенностей тканей и клеток продемонстрировано, что геморрагический панкреонекроз имеет в своем развитии две фазы – донекротическую (геморрагический отек) и некротическую, которые фиксируются в определенной последовательности не только в поджелудочной железе, но и органах брюшной полости. Впервые обнаружено, что даже при тяжелой форме экспериментального панкреонекроза в экзокринном отделе поджелудочной железы сохраняется потенциал клеточной регенерации – двуядерные, «темные» клетки.
Впервые показано, что при введении змеиного яда в клетчатку забрюшинного пространства (исключающем активацию ферментного аутолиза в поджелудочной железе) в боковой стенке живота развивается локальный отечно-некротический процесс с умеренными изменениями висцеральных органов токсического генеза, но при этом отсутствуют явления гемодинамического шока и полиорганной недостаточности. Это доказывает положение о том, что главным фактором полиорганного поражения в рассматриваемой экспериментальной модели панкреонекроза является индукция аутоферментной агрессии с повреждением поджелудочной железы и последующим развитием неуправляемого протеолиза.
Впервые проведена сравнительная патоморфологическая оценка эффективности сандостатина в зависимости от сроков введения препарата на различных стадиях панкреонекроза, индуцированного введением змеиного яда. Применение сандостатина с профилактической целью (за 15 минут), а также на стадии геморрагического отека (через 5-7 мин после введения змеиного яда) сопровождается положительной динамикой – значительным уменьшением распространенности очагов панкреонекроза и выраженности гемодинамических расстройств, отсутствием летальных исходов. Применение сандостатина на этапе выхода деструктивного процесса за пределы поджелудочной железы (через 30-40 мин после введения яда) не предотвращает развитие панкреонекроза и оказывается неэффективным, сопровождаясь гибелью абсолютного большинства лабораторных животных.
Впервые в результате патоморфологического анализа эффекта лечебного применения сандостатина при отечно-некротическом процессе в тканях боковой стенки живота (уменьшение выраженности локальных изменений в зоне введения змеиного яда, снижение местных и общих гемодинамических расстройств и явлений токсемии) получено косвенное подтверждение наличия в спектре положительного действия препарата механизмов, не связанных с подавлением панкреатической секреции.
Впервые продемонстрировано, что раннее применение антисыворотки к змеиному яду при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе на стадии отека дает эффект, который не уступает по степени выраженности действию сандостатина. Отсутствие зависимости положительной динамики от инициирующего фактора (змеиного яда или трипсина) указывает на то, что эффект антисыворотки связан не столько со специфической блокадой антителами белковых компонентов змеиного яда, сколько с неспецифическим подавлением активности фосфолипаз и сериновых протеаз панкреатического сока, индуцирующих процессы ферментного аутолиза и энзимной токсемии.
^ Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе геморрагического панкреонекроза, индуцированного введением змеиного яда. Предложенная модель панкреонекроза может быть использована для разработки новых методов консервативного и оперативного лечения геморрагических форм острого панкреатита.
Проведенные клинические и экспериментальные исследования показали, что при лечении больных панкреонекрозом оптимальной тактикой в раннем периоде заболевания является сочетанное использование в комплексе лечебных мероприятий сандостатина и малоинвазивных технологий, которое позволяет снизить летальность в 1,5 раза, а количество осложнений более чем в 2 раза.
Высокая эффективность раннего применения антисыворотки к змеиному яду при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе открывает перспективы дальнейшего исследования этого препарата для возможного применения в клинической практике при панкреонекрозе и других состояниях, сопровождающихся трипсинемией и активацией системы сериновых протеаз (таких как травма, шок, ДВС-синдром, перитонит, полиорганная недостаточность).
^ Основные положения, выносимые на защиту:
1. Введение яда гадюки обыкновенной в хвост и тело поджелудочной железы в дозе 1 мг/кг вызывает развитие прогрессирующего геморрагического панкреонекроза, сопровождающегося системной панкреатогенной интоксикацией. Экспериментальный геморрагический панкреонекроз имеет в своем развитии две фазы – донекротическую (геморрагический отек) и некротическую, которые фиксируются в определенной последовательности не только в поджелудочной железе, но и органах брюшной полости.
2. Введение змеиного яда в клетчатку забрюшинного пространства в дозе 4 мг/кг вызывает локальный отечно-некротический процесс с умеренными изменениями висцеральных органов токсического генеза, при этом отсутствуют признаки активации ферментного аутолиза в поджелудочной железе, а также явления гемодинамического шока и полиорганной недостаточности.
3. Применение сандостатина с профилактической целью, а также на стадии геморрагического отека уменьшает распространенность очагов панкреонекроза и выраженность гемодинамических расстройств, предотвращает развитие необратимых изменений в поджелудочной железе и органах брюшной полости.
4. Эффект раннего применения антисыворотки к змеиному яду при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе не уступает по степени выраженности действию сандостатина и не зависит от природы инициирующего фактора (змеиный яд или трипсин).
5. Оптимальной тактикой лечения больных геморрагическим панкреонекрозом является раннее использование в комплексе интенсивной терапии сандостатина и малоинвазивных эндовидеохирургических методик.
^ Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в клиническую практику МУЗ ГКБ № 25 г. Новосибирска и ГУ «Дорожная клиническая больница», ст. Новосибирск. Результаты исследования включены в курс лекций на кафедре хирургических болезней факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки врачей в Новосибирском государственном медицинском университете Минздравсоцразвития РФ.
^ Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 4-й Сибирской междисциплинарной научно-практической медицинской конференции «Перспективы лечения вирусных инфекций в 21 веке» (Новосибирск, 1999); конференции хирургов Сибирского региона «Актуальные вопросы абдоминальной и сосудистой хирургии» (Белокуриха, 2002); межкафедральном совещании кафедры хирургических болезней и кафедры общей хирургии, анестезиологии и реанимации факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки врачей Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ (Новосибирск, 2011); межлабораторной научной конференции в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.
^ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает отечественные и иностранные источники. Работа иллюстрирована таблицами, рисунками, панкреатограммами, микрофото- и электронограммами.
^ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положены экспериментальные и клинические исследования, направленные на изучение морфогенеза геморрагической формы острого панкреатита и некоторых методов его коррекции.
^ Характеристика экспериментальных исследований. В экспериментах использованы 250 крыс линии Вистар обоего пола массой тела от 200 до 250 г. Все манипуляции с животными проводили с соблюдением требований приказа МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 года и правил Европейской конвенции по защите животных (Страсбург, 1986). Предварительные серии опытов были посвящены эмпирическому подбору дозы змеиного яда и антисыворотки (всего 8 серий по 5 животных в каждой). Основная группа экспериментов в зависимости от поставленных задач была разделена на 10 серий, по 21 животному в каждой серии (табл. 1).
^ Первый блок экспериментальных исследований посвящен разработке новой модели острого геморрагического панкреатита при помощи введения змеиного яда в ткань поджелудочной железы. При создании новой методики мы опирались на трипсиновую модель (Вискунов В.Г., 2000; Odaira C. et al., 1986), которую использовали в качестве модели сравнения. В зависимости от повреждающего воздействия было сформировано 2 группы:
| ^ Таблица 1. Общая характеристика экспериментальных групп | |||||
| Серия | Метод индукции* | Зона введения инициирующего агента | Метод коррекции | Время коррекции# | Летальность |
| ^ I-й блок. Изучение патоморфогенеза геморрагического панкреонекроза | |||||
| 1 | змеиный яд | поджелудочная железа | - | - | 100% (21) |
| 2 | трипсин | поджелудочная железа | - | - | 90% (18) |
| 3 | змеиный яд | забрюшинная клетчатка | - | - | - |
| ^ II-й блок. Оценка эффективности методов коррекции | |||||
| 4 | змеиный яд | поджелудочная железа | сандостатин | за 15 мин | - |
| 5 | змеиный яд | поджелудочная железа | сандостатин | через 5-7 мин | - |
| 6 | трипсин | поджелудочная железа | сандостатин | через 5-7 мин | - |
| 7 | змеиный яд | поджелудочная железа | сандостатин | через 30-40 мин | 81% (17) |
| 8 | змеиный яд | забрюшинная клетчатка | сандостатин | через 5-7 мин | - |
| 9 | змеиный яд | поджелудочная железа | антисыворотка | через 5-7 мин | - |
| 10 | трипсин | поджелудочная железа | антисыворотка | через 5-7 мин | - |
| Примечание. * – способ индукции экспериментального патологического процесса; # – время введения сандостатина и лошадиной сыворотки против яда гадюки по отношению к началу эксперимента. | |||||
^ 1-я серия экспериментов – индукция экспериментального панкреонекроза раствором сухого яда гадюки обыкновенной (ООО «Сибирский серпентарий», Россия); 2-я серия экспериментов – индукция раствором кристаллического трипсина (ООО «Самсон-Мед», Россия).
Под эфирным наркозом в стерильных условиях выполняли срединную лапаротомию, выводили в рану двенадцатиперстную кишку и по ходу общего желчного протока вводили в тело и хвост поджелудочной железы раствор инициирующего агента в 1 мл дистиллированной воды (по 0,5 мл в каждую зону). При выборе дозировки трипсина (50 мг/кг массы тела животного) опирались на данные В.Г.Вискунов и соавт. (2008). Для змеиного яда на основании предварительных экспериментов адекватной оказалась доза 1 мг/кг массы тела, которая индуцировала геморрагический панкреонекроз и поражение висцеральных органов, при этом динамика патологического процесса соответствовала трипсиновой модели.
^ В 3-й серии экспериментов с целью оценки роли поджелудочной железы при развитии экспериментального патологического процесса змеиный яд в дозе 4 мг/кг массы тела, растворенный в 1 мл дистиллированной воды, вводили после лапаротомии в клетчатку забрюшинного пространства, исключая прямое повреждение поджелудочной железы.
^ Второй блок экспериментальных исследований посвящен анализу эффективности сандостатина и антисыворотки к змеиному яду в коррекции экспериментального геморрагического панкреонекроза, а также косвенной оценке роли дополнительных механизмов в спектре положительного действия сандостатина. Проведено 7 серий экспериментов, различающихся по способу инициации патологического процесса, а также по времени введения сандостатина (Новартис Фарма, Россия) и лошадиной сыворотки против яда гадюки (НПО «Микроген», Россия) в динамике острого панкреонекроза.
Сандостатин вводили под париетальную брюшину с противоположной стороны относительно места введения змеиного яда или трипсина в дозе 0,35 мг/кг массы тела животного (Вискунов В.Г. и др., 2007, 2008; Проценко С.И. и др., 2010). Эффективность применения оценивали на различных стадиях патологического процесса:
- 4-я серия экспериментов – изучали превентивную эффективность сандостатина, который вводили за 15 мин до индукции экспериментального панкреатита змеиным ядом.
- 5-я и 6-я серии экспериментов – сопоставляли эффективность раннего применения препарата при индукции экспериментального процесса змеиным ядом и трипсином. Сандостатин вводили через 5 – 7 мин, в момент появления геморрагического пропитывания.
- 7-я серия экспериментов – исследовали эффективность сандостатина, введенного через 30-40 мин после инъекции змеиного яда в ткань поджелудочной железы, при генерализации патологического процесса.
- 8-я серия экспериментов – для оценки роли механизмов, не связанных с подавлением панкреатической секреции, изучали эффективность сандостатина в дозе 0,5 мг/кг через 5-7 мин после введения змеиного яда в забрюшинную клетчатку.
- 9-я и 10-я серии экспериментов – изучали эффективность раннего (через 5-7 мин) применения антисыворотки к змеиному яду при геморрагическом панкреонекрозе, индуцированном змеиным ядом и трипсином. Дозу антисыворотки определяли эмпирически на основании результатов предварительных серий опытов. Адекватной была признана доза 150 АЕ/кг массы тела животного, обеспечивающая значительное уменьшение выраженности панкреонекроза и гемодинамических расстройств.
Во всех экспериментальных группах проводили трехчасовое наблюдение за макроскопическими изменениями при открытой брюшной полости. Затем живот ушивали, животное помещали в клетку с обычным режимом. Через 24 ч у выживших животных под наркозом выполняли релапаротомию и забирали материал для патоморфологического исследования.
^ Характеристика клинических наблюдений. Проведен анализ результатов лечения 66 больных острым геморрагическим панкреатитом – 37 (56%) мужчин и 29 (44 %) женщин в возрастном диапазоне от 28 до 76 лет (57,81,6 лет) (табл. 2). Автономные формы составляли 57,5% (38), билиарно-зависимые 42,4% (28).