Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза 03. 00. 07 Микробиология 03. 00. 23 Биотехнология
| Вид материала | Автореферат |
- Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических, 373.19kb.
- Разработка диагностической биочиповой тест-системы для одновременного выявления возбудителей, 72.75kb.
- Общая биология и микробиология, 206.6kb.
- Разработка биологических препаратов для повышения питательности и эффективности использования, 672.8kb.
- Учебное пособие по курсу "Биотехнология" для студентов фармацевтического факультета, 1364.67kb.
- Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
- Рабочая программа дисциплины «биотехнология пищевых производств» Код дисциплины, 127.52kb.
- Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством, 660.17kb.
- «Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных, 460.33kb.
- Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов,, 735.56kb.
^ Таблица 3. Результаты объемной реакции агглютинации цветных
диагностикумов в зависимости от использованного
красителя
| №№ п/п | Наименование красителя | Разведения полигрупповых агглютинирующих листериозной и кампилобактериозной сывороток | |||||
| 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 1. | Малахитовый зеленый | 3+ | отр | отр | отр | отр | отр |
| 2. | Бромкрезоловый пурпурный | 4+ | 4+ | отр | отр | отр | отр |
| 3. | Фуксин основной | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ | отр | отр |
| 4. | Бриллиантовый зеленый | 3+ | 3+ | 3+ | отр | отр | отр |
| 5. | Бромфеноловый синий | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ |
| 6. | Метилен виолет | 2+ | 2+ | отр | отр | отр | отр |
| 7. | Фуксин кислый | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | отр | отр |
| 8. | Кристалл виолет | 4+ | 4+ | 2+ | отр | отр | отр |
| 9. | Феноловый красный | 4+ | 2+ | отр | отр | отр | отр |
| 10. | Тиомин синий | 4+ | 3+ | 3+ | 3+ | отр | отр |
| 11. | Трепан синий | 4+ | 4+ | 4+ | отр | отр | отр |
| 12. | Метилен синий | 4+ | 4+ | 4+ | отр | отр | отр |
Со всеми перечисленными сыворотками реакция агглютинации была отрицательная.
До сих пор остаются актуальными и широко используются простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и потому общедоступные серологические тесты и, в частности, РНГА. При отработке биотехнологии изготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов было необходимо решить следующие задачи: подобрать эффективную методику извлечения специфического лиганда из микробных клеток; отработать условия формалинизации эритроцитов барана; подобрать условия сенсибилизации эритроцитов специфическими антигенами. Для извлечения нативных водорастворимых антигенов листерий и кампилобактерий мы сочли целесообразным использовать режим ультразвуковой дезинтеграции микробных клеток в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка (Афанасьев Е.Н., 1984). Экстракция осадка 5% раствором хлористого натрия и выделение второго супернатанта позволяют в максимальной степени извлечь антигены из бактериальной массы, а фракционирование антигенов из супернатантов сульфатом аммония, помимо концентрирования и очистки, приводит к стабилизации белков (рисунок 1).
В связи с тем, что у всех серотипов кампилобактерий имеется общий белковый антиген, содержащийся в жгутиках, а одним из важнейших поверхностных антигенов является кислоторастворимая белковая фракция (Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., 1999), дополнительно в вышеназванную схему при получении кампилобактериозного полигруппового антигена мы ввели этап экстрагирования раствором соляной кислоты. При этом антигеный комплекс изолировали из биомасс кампилобактерий подвидов jejuni, coli, fetus.
Полигрупповые антигены иммобилизовали на поверхности эритроцитов барана, формализованных по методу М.И.Леви с соавт. (1962), при этом активацию их поверхности проводили 2 % раствором вторичного ал-
килсульфата натрия. Оптимальная нагрузка лигандов равнялась 1000 мкг/мл по белку при следующих условиях конъюгации: концентрация эритроцитов -20 %; температура их связывания с сенситином – 450С; pН раствора – 5,0 в течение (18 ±2) часов.
Выращиввание культур на питетельной среде
Смыв биомассы 0,9 % раствором NaCl (рН 7,4) , стерилизация холодным (-300) ацетоном 24 часа
Центрифугирование при 4000 об/мин (35±5) мин; высушивание биомассы в анаэростате
Разрушение микробных клеток
методом экструзии
Центрифугирование при 20000 об/мин (40±5) мин
Детрит
Супернатант 1
Суспендирование в 3 % растворе NaCl; УЗ-дезинтеграция при 44 кГц 15 мин
Экстрация на холоду (4 0С) 24 часа 3% NaCl + 1 % цетавлона
Центрифугирование при 20000 об/мин (40±5) мин
Супернатант II
Для кампилобактериозного антигена: экстракция осадка 0,05 Н HCl
Осадок отбрасывают
Центрифугирование при 20000 об/мин (40±5) мин
Супернатант III
Центрифугирование при 20000 об/мин (40±5) мин
Осадок растворяют в дН2О и диализуют против дН2О 24 часа при 40С
Супернатант
отбрасывают
Розлив в ампулы. Лиофильное высушивание антигена
Высаливание до 80% насыщения (NH4)2SO4
Рисунок 1. Схема получения полигрупповых
антигенных комплексов
При контроле полученных серий эритроцитарных антигенных листериозного и кампилобактериозного диагностикумов титры специфических антител в РНГА выявлялись в разведениях 1:5120 – 1:10240. При изучении специфичности на коммерческих агглютинирующих сыворотках перекрестных реакций не наблюдалось.
^ Конструирование листериозных и кампилобактериозных полигрупповых иммуноглобулиновых флуоресцирующих и иммунопероксидазных коньюгатов
Для экспресс-индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза нами изготовлены полигрупповые флуоресцирующие и иммунопероксидазные конъюгаты. При их получении было необходимо иметь высокока-
чественное сырье – высокоспецифичную и высокоактивную гипериммунную сыворотку.
С учетом накопленного опыта и теоретических предпосылок ранее мы предложили и экспериментально обосновали схему иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток: антигенный материал пятикратно
вводили внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуномодулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно циклофосфан (N1- бис/β-хлорэтил)- N1-O-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты) (таблица 4).
^ Таблица 4. Схема иммунизации кроликов с применением
иммуномодуляторов тималина и циклофосфана
| № инъекции | Интервал между инъекциями сутки | Количество вводи- мого антигена, мкг | Способ введения антигена | Иммуномодуляторы | ||||
| Тималин | Циклофосфан | |||||||
| Листе- риозный | Кампи- лобакте риозный | Доза, мг | Способ введе- ния | Доза, мг | Способ введе- ния | |||
| 1 | - | 1000 | 1000 | в/в | 5 | в/м | - | - |
| 2 | 6-7 | 1250 | 1250 | в/в | 5 | в/м | - | - |
| 3 | 6-7 | 1500 | 1500 | в/в | 5 | в/м | 100 | в//м |
| 4 | 6-7 | 1750 | 1750 | в/в | 5 | в/м | - | - |
| 5 | 6-7 | 2000 | 2000 | в/в | 5 | в/м | - | - |
Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических сывороток антител за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизирует макрофаги, стимулируя фа-
гоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом Т- лимфоцитов) функции (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985). Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора – с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других.
При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала – 7550 мкг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных-продуцентов при определении в РИД достигали показателей 1:15,4 ± 1, 25 – 1:28,8 ± 2,5, а в НРИФ – не ниже 1:13926,4 ± 1372,16.
Такие характеристики соответствовали требованиям оценки сырья для производства иммунобиологических препаратов. Материалы защищены патентом РФ на изобретение № 2135210 «Способ получения диагностической сыворотки» (Бюл. №24 от 27.08.99).
Дальнейшее проведение исследований позволило нам предложить новую схему гипериммунизации кроликов с одним иммунокорректором – тимогеном, при этом удалось значительно снизить антигенную нагрузку при иммунизации.
Применение тимогена сопровождается мобилизацией регуляторных и эффекторных механизмов адаптации организма к воздействию ксенобиотических факторов. Эффекты препарата на клеточном уровне включают в себя специфическое связывание с мембраной лимфоцитов, активацию систем вторичных посредников и регуляцию функционального состояния лимфоидных клеток через цАМР-зависимые протеикиназы. Важно отметить, что доза тимогена, при которой наблюдается усиление процессов дифференцировки лимфоидных клеток и экспрессия рецепторов на лимфоцитах, в 10-1000 раз меньше, чем в природных препаратах вилочковой железы, в том числе и тималина (Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1982, Демидов С.В., Костромин А.П., Чернушенко Е.Ф. и др., 1990; Морозов В.Г., 1990).
Схема иммунизации состояла из следующих манипуляций: кроликам-продуцентам вводили внутривенно каждые пять дней водорастворимые полигрупповые антигенные комплексы листерий и кампилобактерий в увеличивающихся дозах. В эти же сроки внутримышечно инъецировали по 10 мкг тимогена. На 7-10 день после последнего введения иммуногена животных кровопускали (таблица 5).
Активность гипериммунных сывороток, полученных по этой схеме, в РИД составляла 1: 28,8 ± 2,5 – 1:53,3 ± 5,01, в НРИФ – 1:13926,4 ± 1372,16 – 1:24576 ± 2744,32.
^ Таблица 5. Схема иммунизации кроликов с применением тимогена
| № инъекции | Интервал между инъекциями, сутки | Количество вводимого антигена, мкг | Способ введения антигена | Тимоген | ||
| Листериозный | Кампило- бактериоз- ный | Доза, мкг | Способ введения | |||
| 1 | - | 30 | 30 | в/в | 10 | в/м |
| 2 | 5 | 60 | 60 | в/в | 10 | в/м |
| 3 | 5 | 120 | 120 | в/в | 10 | в/м |
| 4 | 5 | 240 | 240 | в/в | 10 | в/м |
Благодаря применению иммунокорректора тимогена, обладающему полифункциональным действием, значительно сокращены дозировки вводимого антигенного материала (с 7550 мкг до 450 мкг), иммунокорректора – в 500 раз, длительность процесса иммунизации с 35 дней до 22 дней, при этом повышен выход целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных-продуцентов с одновременным уменьшением трудозатрат.
При сравнительном анализе методов выделения специфических иммуноглобулинов класса G (сульфатом аммония, каприловой кислотой, полиэтиленгликолем – 6000) и дальнейшей их метке флуорохромом и ферментом оказалось, что наиболее активные флуоресцирующие конъюгаты были получены при использовании IgG, выделенные каприловой кислотой, а энзиммеченные – IgG - полиэтиленгликолем. При этом для повышения специфичности листериозных полигрупповых иммуноглобулиновых конъюгатов были использованы F(ав)2 – фрагменты, выделенные из соответствующих IgG ферментативным гидролизом в кислой среде. Разработанные биотехнологии позволили получать высокоактивные, чувствительные и специфичные диагностические препараты, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к подобным диагностикумам.
Разработка тест-систем магноиммуносорбентных для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза в иммуноферментном анализе и количественной реакции иммунофлуоресценции
Эффективность ряда методов индикации и выделения возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования микробов и антигенов с отделением их от контаминирующей микрофлоры и примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магноиммуносорбенты служат в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности патогенов (Брыкалов А.В., Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Ефременко В.И., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000; Yu H., 1998; Jaykus Lee, 2000).
Нами впервые разработаны кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбенты на основе органокремнезема – алюмосиликата, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера – декстрана и поверхностно-активного вещества – вторичного алкилсульфата натрия. Для придания сорбенту магнитных свойств в его состав вводили оксид железа. Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (алюмосиликат, полиглюкин, F2O3), а также изучено влияние времени гелеобразования и pH среды на величину удельной поверхности сорбента, объем и размер пор (таблица 6). На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 1:1:2, соответственно алюмосиликат, декстран, F2O3; время гелеобразования - 2 часа, рН гелеобразования – 7,0. Исследование удельной поверхности показало, что сорбент, не содержащий в своем составе F2O3, имеет удельную поверхность – 58 м2/г, объем пор – 1,70 см3/г, радиус – 42,5 нм. Введение оксида железа в структуру кремнеземного сорбента изменяет его структурные характеристики: удельная поверхность имеет значение 18 м2/г, объем пор – 1,19 см3/г, радиус пор – 132,2 нм.
^ Таблица 6. Структурные характеристики МС в зависимости от количества Fe2O3 и времени гелеобразования
| Массовое соотношение компонентов синтеза | Время гелеобразо- вания, ч | Удельная поверх- ность, м2/г | Объем пор, см3/г | ^ Радиус пор, нм | ||
| Al – SiO2 | декстран | Fe2O3 | ||||
| 2,5 | 2,5 | 0,5 | 2 | 25,6±0,5 | 1,23±0,08 | 95,3±0,08 |
| 8 | 27,6±0,49 | 1,23±0,008 | 93,3±0,06 | |||
| 2,5 | 2,5 | 1,0 | 2 | 24,8±0,64 | 1,23±0,005 | 97,6±0,49 |
| 8 | 28,5±0,51 | 1,23±0,007 | 95,7±0,12 | |||
| 2,5 | 2,5 | 1,5 | 2 | 24,3±0,48 | 1,21±0,008 | 101,6±0,12 |
| 8 | 31,5±0,74 | 1,22±0,006 | 99,6±0,1 | |||
| 2,5 | 2,5 | 2,0 | 2 | 22,6±0,49 | 1,21±0,006 | 105,2±0,06 |
| 8 | 32,3±0,25 | 1,21±0,003 | 99,7±0,08 | |||
| 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2 | 18,5±0,51 | 1,19±0,008 | 126,4±0,1 |
| 8 | 33,8±0,15 | 1,19±0,008 | 101,7±0,1 | |||
| 2,5 | 2,5 | 5,0 | 2 | 17,5±0,51 | 1,18±0,009 | 132,3±0,1 |
| 8 | 34,6±0,25 | 1,18±0,01 | 103,1±0,08 |
Аффинность сорбенту придавали белковые специфические лиганды, которыми при конструировании кампилобактериозных МИС служили иммуноглобулины из гипериммунных полигрупповых сывороток, выделенные полиэтиленгликолем, а для листериозных МИС – F(ab)2 – фрагменты иммуноглобулинов листериозных.
Исследования показали, что концентрация белка лигандов 2,5-3 мг/мл является оптимальной для полного насыщения сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси МИС. При использовании белка с концентрацией больше 2,5
мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. При изучении кинетики процесса иммобилизации и оценке связывания белковых лигандов с сорбентом установлено, что для полного насыщения МС белком достаточно 2 часов при значении рН раствора белка 6-7 и температуре от 22 до 370С. Полученные магноиммуносорбенты характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Принципиальная схема получения МИС представлена на рисунке 2.
На основе МИС нами впервые сконструированы диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза МИС+ИФА, подобраны условия постановки ИФА с МИС. При использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистероловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы, время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА. Нами также впервые сконструированы магноиммуносорбентные диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителей кампилобактериоза и листериоза в количественном иммунофлуоресцентном анализе, оптимизированы варианты постановки КИФА. МИС+КИФА обладает селективным концентрированием, высокой чувствительностью (1х102 м.к./пробе), значительно превышающей чувствительность традиционного иммунофлуоресцентного анализа, специфичностью, быстротой постановки реакции (50-60 мин), возможностью учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально ( в условных единицах по показаниям вольтметра), при этом отпадает необходимость приготовления мазков и их фиксации.
Алюмосиликат
Декстран
Оксид железа
Соотношение компонентов синтеза 1:1:2
Получение гидрогеля в течение 2 часов при температуре (22±4) 0С
Получение ксерогеля при температуре 100-110 0С
30 минут
Механическое
измельчение
Выделение высокодисперсной фракции через мельничный газ
Активация сорбента при температуре 37 0С 1 час
Вторичный алкилсульфат натрия
Иммобилизация сорбента 2 часа при температуре 22-37 0С
Белковый лиганд 2,5-3 мг/мл
Отмывка МИС от несвязавшегося лиганда
I стадия
II стадия
Рисунок 2. Принципиальная схема получения МИС
Способность магноиммуносорбентов прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать не своей поверхности искомый патоген дает возможность исследовать широкий диапазон проб, в том числе и сильно загрязненных, и их объемов (от нескольких микролитров до многих кубических метров жидкости), осуществлять тщательную промывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций, тем самым повышая достоверность как положительных, так и отрицательных результатов.
Все разработанные нами МИБП, а также биологическое сырье для их производства нуждались в стабилизации исходных свойств. В настоящее время наилучшим методом для сохранения свойств биополимеров является лиофильное высушивание препаратов. В связи с тем, что названные выше диагностические препараты и сырье для них имеют свой порог биодеградации, необходимо было отработать единый, оптимальный, экономичный режим их высушивания. При сублимации мы использовали различные криозащитные среды, подобранные нами для каждого биообъекта. Сублимацию проводили на установке для сублимационной сушки (LZ-9С или TG -5) с использованием двух режимов: «умеренного» (длительность удаления свободной воды – (12,5±1) час, связанной влаги – (10,5±1) час, конечная температура подогрева – (25±1) 0С) и «жесткого» (длительность периода сублимации и изотермического отторжения влаги в течение 6 часов с подогревом материала до (45 ±2,5)0С, общая длительность процесса сушки – 16 часов). После лиофилизации «умеренным» и «жестким» режимами, а также через 5 лет хранения (срок наблюдения) показатели контроля специфической активности и чувствительности всех медицинских иммунобиологических препаратов, разработанных нами, а также биологического сырья для их производства оставались на уровне исходных. Результаты этих экспериментов позволяют рекомендовать довольно жесткий экономичный режим сублимации при производстве диагностических препаратов.
В итоге проведенных исследований составлена принципиальная схема производства, которая складывается из последовательных стадий и операций, характерных для каждого конкретного препарата, определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 3).
Характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов
Контроль К,
ОБТК
Выращивание биомассы бактерий
АНТИГЕНЫ
К1; К2 , В
Корпускулярные
Водорастворимые белковые
Диагностикум для РА
Для конъюгации
Для иммунизации
Иммунная сыворотка
К4;К5,
В
К4;К5,
ОБТК
К4;К5,
ОБТК
Диагностическая сыворотка для РА
Сорбция сыворотки
Аффинный сорбент
К3;К4; К5, В
Иммуноглобулины
(IgM, IgG)
Выделение иммуноглобулинов
Конъюгирование
С ферментом
С флуоресцирующим красителем
С эритроцитами
Иммуноферментные (для ИФА и ФЛА)
Магноиммуносорбенты (для ИФА, КИФА)
К4;К5, В
К4;К5,В
К3, К4, В